一种人源SARS-CoV-2单克隆抗体的制备及其应用

本发明涉及医疗，尤其涉及一种人源sars-cov-2单克隆抗体的制备及其应用。

背景技术：

1、新型冠状病毒感染患者发病后轻则发烧无力、嗅觉味觉障碍，重则呼吸困难，最后发展为多器官功能衰竭。新型冠状病毒，属冠状病毒科冠状病毒属β亚属，具有包膜，刺突蛋白位于包膜上。病毒利用刺突蛋白结合于细胞表面的血管紧张素转化酶 2（angiotensinconverting enzyme 2，ace2）进入细胞。因此刺突蛋白是新型冠状病毒肺炎疫苗或单克隆抗体制备的重要靶点。单克隆抗体由于其特异性好，在科研、诊断有着广泛的应用。近年来，单细胞pcr 技术制备单克隆抗体技术兴起，可以大批量筛选特异性单克隆抗体。本研究基于单细胞 pcr 技术制备新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体。

2、冠状病毒属于套式病毒目(nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、冠状病毒属(coronavirus)，是目前人类已知的rna病毒中基因组最大的病毒，其长度为27至32kb。冠状病毒有至少4个主要结构蛋白，包括刺突蛋白(s)，膜蛋白(m)，包膜蛋白(e)和核衣壳(n)蛋白，这些蛋白对于病毒与细胞受体结合至关重要，都是构成病毒完成结构所必需的。其中核衣壳蛋白(n)是一种碱性磷蛋白，其中央区与病毒基因组rna结合，形成卷曲的核衣壳螺旋，是包裏病毒遗传物质的核心结构，在感染细胞中是表达量最高的病毒蛋白之一。

3、最初的单克隆抗体的制备技术是杂交瘤技术。该方法将小鼠b淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交细胞系就是杂交瘤，杂交瘤可以持续大量分泌特异性单克隆抗体。但是随着对这种抗体的认识不断加深，人们在临床发现，由于物种不相容性，这些抗体在人体内会产生针对鼠抗体的中和抗体，从而降低甚至抵消其治疗效果，更不用说过敏反应导致的风险。因此，核心问题是产生人源化抗体。随着分子生物学和免疫学方法技术的进步，人源化抗体的制备可以通过人源化抗体改造、表达人类抗体基因的转基因小鼠或通过噬菌体展示来完成。利用噬菌体展示技术是一种比较新的产生人源化抗体的方法，从淋巴细胞中获得完整的人的可变区基因，然后克隆抗体可变区至噬菌体外壳蛋白结构基因组上并随着噬菌体的重新组装在噬菌体表面表达。通过与特定的抗原的结合筛选噬菌体，并通过多轮突变改进结合的抗体。这一整个过程模拟了具有一系列特异性结合表位的 b 淋巴细胞群自然免疫选择的过程。

4、单细胞pcr技术是一个细胞内的dna或rna作为模板进行pcr。近年来，随着单细胞pcr技术的广泛地运用，人们开始将单细胞pcr技术用作抗体制备的技术。b淋巴细胞含有表达抗体的成熟转录本。单细胞pcr技术与其他技术相比，不仅使用样本量很少，而且可以获得自然条件下重轻链配对的抗体可变区基因。同时由于体内抗体已经经历过了亲和力成熟，不用再像噬菌体展示技术通过多轮突变改进结合的抗体，更加高效。使用单细胞 pcr技术制备单克隆抗体可以低样本量、高通量、自动快速、高特异性的得到全人源的单克隆抗体，从而将得到的来自每个单个细胞的重链和轻链可变区序列克隆到表达载体上，瞬转细胞表达并纯化抗体。

技术实现思路

1、本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种人源sars-cov-2单克隆抗体的制备及其应用，本发明获得天然配对的人源抗sars-cov-2单克隆抗体的体外诊断以及治疗效果检测。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种人源抗sars-cov-2单克隆抗体，以新冠疫苗志愿者的外周血记忆b细胞进行单细胞pcr得到抗体可变区序列，然后再体外表达纯化获得；本发明提供的人源sars-cov-2单克隆抗体，是一种igg，其轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成，其重链由重链可变区、铰链区和重链恒定区组成；所述抗体可变区序列分为抗体轻链可变区和抗体重链可变区，抗体轻链可变区如下（a）或（b）：（a）序列表的序列1自5’末端第1-312位核苷酸所示的dna分子和序列2自5’末端第1-369位核苷酸所示的dna分子；（b）序列表的序列1和2所对应的蛋白质即序列5自n端第1-104位氨基酸所示的蛋白质分子和序列6自n端第1-123位氨基酸所示的蛋白质分子；所述的抗体重链可变区为如下（c）或（d）：（c）序列表的序列3自5’末端第1-420位核苷酸所示的dna分子和序列4自5’末端第1-417位核苷酸所示的dna分子；（d）序列表的3和4所对应的蛋白质即序列7自n端第1-140位氨基酸所示的蛋白质分子和序列8自n端第1-139位氨基酸所示的蛋白质分子。

4、一种编码人源抗sars-cov-2单克隆抗体的基因的方法，包括有编码轻链的基因和编码重链的基因，具体如下：

5、编码轻链的基因为如下（1）或（2）：

6、（1）序列表的序列1所示的dna分子；

7、（2）序列表的序列2所示的dna分子；

8、编码重链的基因为如下（3）或（4）：

9、（3）序列表的序列3所示的dna分子；

10、（4）序列表的序列4所示的dna分子。

11、一种人源抗sars-cov-2单克隆抗体的制备方法，从新冠疫苗志愿者外周血中分离得到记忆b淋巴细胞，利用单细胞pcr方法获得抗体序列，并克隆进抗体表达载体中，在体外进行表达纯化。具体如下：

12、1.分离疫苗免疫志愿者外周血单核细胞；

13、2.流式分选抗原特异性记忆b细胞；

14、3.单细胞 pcr 扩增抗体可变区基因；

15、4.将天然配对的抗体重轻链构建到体外表达抗体的载体上；

16、5.体外表达并纯化人源抗sars-cov-2单克隆抗体。

17、人源抗sars-cov-2单克隆抗体对抗原识别的检测

18、所述的人源抗sars-cov-2单克隆抗体在制备用于检测诊断sars-cov-2中的应用。

19、所述的人源抗sars-cov-2单克隆抗体在制备用于检测诊断sars-cov-2中的应用，所述诊断可检测sars-cov-2刺突蛋白。

20、一种用于治疗sars-cov-2的药物，其活性成分为所述的人源抗sars-cov-2单克隆抗体。

21、可以竞争性与sars-cov-2刺突蛋白竞争性结合到细胞膜表面ace2受体上。

22、所述的人源抗sars-cov-2单克隆抗体在制备用于sars-cov-2的检测中的应用以及在sars-cov-2治疗药物中的应用。

23、本发明的优点是：本发明对灭活病毒疫苗免疫志愿者得到的全血分离得到外周血淋巴细胞，用荧光标记抗体对记忆 b 淋巴细胞表面分子 cd3-cd19+cd27+igg+进行区分，通过流式细胞术分选得到新冠病毒刺突蛋白特异性的记忆 b 细胞，利用单细胞逆转录试剂盒和特异性引物从记忆 b 细胞中扩增得到一对匹配的抗体可变区基因序列，将其构建到抗体表达载体。然后在hek293t细胞中表达纯化出抗体并初步检测其功能和效价。本发明单克隆抗体的制备用于新冠治疗药物中，可应用于sars-cov-2的检测试剂盒，对sars-cov-2病毒的诊断、治疗具有重大应用价值。