葫芦轻花叶病毒及其侵染性克隆载体、构建方法和应用

本发明涉及基因工程，特别是涉及一种含rna1和rna2组分的正单链rna病毒葫芦轻花叶病毒(cucurbit mild mosaic virus，cummv)及其侵染性克隆载体、构建方法和应用。

背景技术：

1、葫芦轻花叶病毒cummv是fabavirus病毒属成员，最初被发现侵染南瓜引起叶片花叶症状；之后被发现能侵染葫芦科作物的多年生作物瓜蒌，引起叶片上花叶的症状。fabavirus是secoviridae科comovirinae亚科的病毒属，目前该属已经有8个确定的病毒种。fabaviruses在一些单子叶和许多双子叶中有广泛的宿主范围，已知它们以蚜虫为介体以非持续性的方式进行传播。

2、fabaviruses是一种正单链rna病毒，基因组由两个rna即rna1和rna2组成，其中rna1为5.8-6.4kb，rna2为3.1-4.1kb；rna1和rna2各编码一个多聚蛋白，并被加工成有功能的蛋白质。rna1编码与复制和表达相关的蛋白，包括蛋白酶所需的辅助因子(co-pro)，推定解旋酶(hel)，基因组-连接蛋白(vpg)，蛋白酶(pro)和rna依赖的rna聚合酶(rdrp)。rna2编码运动蛋白(mp)和两种外壳蛋白(lcp和scp)。作为fabavirus属唯一自然条件下侵染葫芦科作物的病毒，cummv仅公布了全基因组序列，缺乏对该病毒生物学特性、致病性等方面的了解。

3、植物病毒的侵染性cdna克隆是研究病毒蛋白功能及病毒与寄主的相互作用的有力工具。通过对植物侵染性克隆基因进行靶向修饰可用于研究植物病毒基因或序列的功能。基于病毒侵染性克隆的衍生载体，例如插入报告基因(β-葡萄糖醛酸酶gus、绿色荧光蛋白gfp等)，可用来跟踪植物病毒在植物中的运动。然而，在fabavirus属中，仅有少部分物种的侵染性克隆被成功构建。

4、目前，未见cummv侵染性克隆的报道。部分病毒具有保守的表达特性，需要准确、完整的序列才能实现表达，对于一些含ploya尾序列的病毒，则需要添加适量的ploya尾实现病毒的致病性；在病毒基因组获得、重组转化及质粒培养、菌株表达等过程都会对病毒的致病性产生影响，需要基于病毒特性、精细把控各环节，从而实现有活性的病毒侵染性克隆的构建。

技术实现思路

1、本发明的第一目的是提供一种葫芦轻花叶病毒。

2、本发明的第二目的是提供一种侵染性克隆载体及其构建方法和应用。

3、本发明在获得侵染瓜蒌的葫芦轻花叶病毒rna1和rna2全基因组序列基础上，在外源序列引入、基因重组、菌株培养、质粒转化等方面进行了优化，基于含有35s启动子的植物双元表达载体pcb301，分别构建了葫芦轻花叶病毒rna1和rna2全长cdna序列的侵染性克隆，通过农杆菌介导转化后在寄主体内转录、复制、侵染，以用于病毒的功能基因组研究。

4、为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

5、一种葫芦轻花叶病毒(cucurbit mild mosaic virus，cummv)，其rna1和rna2全基因组序列如seq id no：21-22所示。

6、本发明所述的葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆载体，分别由葫芦轻花叶病毒cummv的rna1和rna2的全基因组序列融合到带35s启动子和核酶rz的载体pcb301制备得到。

7、进一步的，由葫芦轻花叶病毒cummv的rna1和rna2全基因组序列添加ploya尾后融合到带35s启动子和核酶rz的载体pcb301制备得到。

8、该葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆载体的制备方法，包括以下的步骤：

9、(1)获得葫芦轻花叶病毒cummv的rna1和rna2核苷酸全序列﹔

10、(2)将cummv的rna1分为3段，rna2分为2段，分别设计同源重组引物cummv-rna1-insert1f/1r，cummv-rna1-insert2f/2r，cummv-rna1-insert3f/3r，以及cummv-rna2-insert1f/1r，cummv-rna2-insert2f/2r，以瓜蒌病叶rna反转录的cdna为模板进行片段扩增，获得rna1的三个片段：cummv-rna1-insert1、cummv-rna1-insert2和cummv-rna1-insert3以及rna2的两个片段cummv-rna2-insert1和cummv-rna2-insert2。

11、所述引物cummv-rna1-insert1f/1r，cummv-rna1-insert2f/2r，cummv-rna1-insert3f/3r，cummv-rna2-insert1f/1r和cummv-rna2-insert2f/2r的基因序列分别如seqid no：1-10所示；

12、(3)选用stui和smai双酶切pcb301载体，产物与步骤(2)获得的扩增片段进行切胶回收纯化，纯化产物进行同源重组反应，连接产物转化进大肠杆菌后，筛选目的片段插入为阳性的单克隆，进一步测序验证从而获得具有cummv rna1和rna2基因组核苷酸全序列的克隆pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2；

13、(4)提取含pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2的质粒，获得葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆载体。

14、其中，所述步骤(1)具体包括：

15、1.1)将产生花叶、斑驳、褪绿等疑似受病毒侵染的瓜蒌植物病叶总rna的提取，将样品进行小rna测序；

16、1.2)cummv核苷酸全序列的扩增：根据小rna测序结果组装的contigs，结合病毒数据库中其它cummv的基因组序列，设计基因组扩增引物进行序列扩增，对于cummv的rna1组分，设计三对扩增引物cummv-rna1-1f/1r，cummv-rna1-2f/2r，cummv-rna1-3f/3r(如seqid no：11-16)进行扩增；对于rna2组分，设计两对扩增引物cummv-rna2-1f/1r，cummv-rna2-2f/2r(如seq id no：17-20)进行扩增。扩增产物经胶回收纯化后连接t载体，转化到大肠杆菌，筛选阳性克隆后提取质粒测序，序列拼接获得cummv的全基因组。

17、其中，所述步骤1.2)中的pcr扩增体系为：10μl 5×transstart fastpfu buffer、4μl 2.5mm dntps、上下游引物10μm各1μl、1μl cdna模板、1μl transstart fastpfu dnapolymerase，32μl ddh2o，总反应体系为50μl；各片段的反应条件为：95℃3min；95℃20s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃8min。

18、其中，所述步骤(3)中重组反应采用10μl反应体系，其中经stui和smai双酶切线性化克隆载体pcb301 20ng左右，片段cummv-rna1-insert1、cummv-rna1-insert2和cummv-rna1-insert3各50ng左右(或cummv-rna2-insert1、cummv-rna2-insert2各50ng左右)，5×ceⅱbuffer 4μl，exnaseⅱ1μl，ddh2o补足体系至10μl；重组反应条件为37℃30min。

19、其中，所述步骤(4)中插入pcb301-cummv-rna1和pcb301-cummv-rna2质粒大肠杆菌的培养条件为，37℃220rpm、避光培养14h。

20、一种携带葫芦轻花叶病毒侵染性克隆的农杆菌菌株，由上述的葫芦轻花叶病毒侵染性克隆载体由电击转化法导入到农杆菌菌株eha105获得。

21、本发明上述的侵染性克隆载体及农杆菌菌株可以用于葫芦轻花叶病毒的致病性分析、病毒基因功能研究。

22、同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

23、(1)本发明获得了侵染瓜蒌的葫芦轻花叶病毒全基因组，并将病毒rna1和rna2全长cdna转入高效植物表达载体pcb301上，避免插入突变和碱基缺失，同时添加适宜的ploya，将rna1和rna2重组载体分别经电击高效转化到农杆菌中，使其具备了高效的侵染能力。本发明为研究葫芦轻花叶病毒的基因组结构、功能、侵染机理及植物与病毒的相互作用等研究提供了成熟的体系。

24、(2)本发明提供的农杆菌菌株可以大量产生葫芦轻花叶病毒的侵染性克隆。

25、(3)采用本发明提供的侵染性克隆载体能高效侵染瓜蒌、黄瓜等多种葫芦科作物，易于操作、重复性好。

26、(4)利用本发明提供的侵染性克隆载体可有效用于葫芦轻花叶病毒的致病性分析。

27、下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的葫芦轻花叶病毒及其侵染性克隆载体、构建方法和应用作进一步说明。