基于Crispr-Cas系统的多重检测试剂盒的制作方法

本技术涉及基因编辑和基因诊断领域，是基于crispr反式切割系统开发的核酸检测方法，涉及在rna的介导下由cas12家族蛋白以及它的变体进行的选择性切割靶向dna、rna多重检测方法的建立以及相关检测试剂盒开发的技术基础确立，未来可应用于遗传诊断分型、检验检疫等方向。

背景技术：

1、基于crispr技术建立的核酸检测平台由于其具有高灵敏度、便携化、高特异性的特点得到了越来越多的关注。而病毒会发生突变，基因也会呈现多态性，因此病毒与基因诊断的分型需求要求多重核酸检测平台的建立。基于crispr的多重核酸检测这一领域，新一代分子诊断技术，具有改变分子诊断领域格局的前景。cas13由于具有ssrna反式切割活性已经被开发用于rna检测。基于crispr-cas13的rna检测平台称为sherlock，结合等温扩增技术可以检测寨卡病毒和登革热病毒、鉴定病原菌、snp分析。2018年，利用crispr核酸酶cas13a、cas12a、csm6结合等温扩增技术建立了sherlockv2，使核酸检测实现多重化、定量化和试纸化。而之后基于crispr的多重检测没有太大的突破。但是随着世界上多种病毒的爆发，且由于这些病毒所产生的症状不同治疗方案也就不同，为了更有针对性的治疗和康复，让社会对于病毒毒株的分型有了更多的需求。因此，双重或者多重检测平台的建立具有了更重要的实际意义。

技术实现思路

1、本技术因此提供了：

2、1.一种对生物样本中存在的两种以上靶标遗传物质同时进行检测的方法，其中，所述方法包括：

3、向所述生物样本中添加两种以上能够分别靶向两种以上所述靶标遗传物质的crispr-cas系统以及两种以上与所述crispr-cas系统对应的探针分子；

4、当任意所述crispr-cas系统遇到其靶向的靶标遗传物质时，所述crispr-cas系统中的cas酶能够被其靶向的靶标遗传物质激活从而反式切割其所对应的探针分子；

5、对被反式切割的探针分子所发出的荧光信号进行检测从而确定在所述生物样本中是否存在所述靶标遗传物质。

6、2.根据项1所述的方法，其中，

7、所述crispr-cas系统包括cas酶或者能够表达cas酶的核酸、以及能够与所述靶标遗传物质特异性结合的向导分子；

8、优选所述两种以上crispr-cas系统选自下组中的两项以上：crispr-cas12i系统、crispr-cas12b系统、crispr-casx系统、crispr-cas12a系统；更优选所述两种以上crispr-cas系统为crispr-cas12i系统和crispr-cas12b系统，而所述向导分子为sgrna和crrna。

9、3.根据项2所述的方法，其中，

10、所述两种以上探针分子分别具有多个重复核苷酸构成的序列，并且所述两种以上探针分子的所述重复核苷酸序列在不同位置上的磷酸二酯键被修饰，优选被硫代修饰；

11、而且所述两种以上探针分子具有与各自重复核苷酸序列连接的荧光-淬灭基团(fq)；优选所述两种以上荧光-淬灭基团选自下组中的两项以上：fam-bhq1、hex-bhq1、rox-bhq2、cy3-cy5、tet-dabcyl、fam-7t-dabcyl、fam-bhq2、cy3-bhq2、cy5-bhq2、joe-bhq1。

12、4.根据项3所述的方法，其中，所述两种以上靶标遗传物质是来自不同生物样本的遗传物质或来自于同一生物样本的不同的遗传物质。

13、5.根据项4所述的方法，其中，在所述两种以上探针分子中，第一探针分子和第二探针分子的结构为fq-poly-7t、fq-poly-7a或fq-poly-7c序列，优选第一探针分子和第二探针同时为fq-poly-7t序列。

14、6.根据项5所述的方法，其中，所述第一探针分子在第一个t和第二个t之间的磷酸二酯键被修饰，所述第二探针分子在第六个t和第七个t之间的磷酸二酯键被修饰，优选被硫代修饰。

15、7.根据项2所述的方法，其中，优选地，所述crispr-cas12b为相对其野生型发生了e475r+q119f+e758r替换的工程化cas12b；优选地，而所述crispr-cas12i为相对其野生型发生了n164y+e176r+k238r+t447r+e563r+e323r+d362r替换的工程化cas12i；其中，所述工程化cas12i如seq id no:7所示，而所述工程化cas12b如seq id no:13所示。

16、8.一种针对生物样本所携带的两种以上靶标遗传物质对生物样本进行多重检测的试剂盒，其中，

17、所述试剂盒包括两种以上靶向所述靶标遗传物质的crispr-cas系统以及在所述crispr-cas系统被所述靶标遗传物质激活后能够被所述crispr-cas系统反式切割并发出荧光信号的探针分子。

18、9.根据项8所述的试剂盒，其中，

19、所述crispr-cas系统包括cas酶或者能够表达cas酶的核酸、以及能够与所述靶标遗传物质特异性结合的向导分子；

20、优选所述两种以上crispr-cas系统选自下组中的两项以上：crispr-cas12i系统、crispr-cas12b系统、crispr-casx系统、crispr-cas12a系统；更优选所述两种以上crispr-cas系统为crispr-cas12i系统和crispr-cas12b系统，而所述向导分子为sgrna和crrna。

21、10.根据项9所述的试剂盒，其中，

22、所述两种以上探针分子分别具有多个重复核苷酸构成的序列，并且所述两种以上探针分子的所述重复核苷酸序列在不同位置上的磷酸二酯键被修饰，优选被硫代修饰；

23、而且所述两种以上探针分子具有与各自重复核苷酸序列连接的荧光-淬灭基团(fq)；优选两种以上所述荧光-淬灭基团选自下组中的两项以上：fam-bhq1、hex-bhq1、rox-bhq2、cy3-cy5、tet-dabcyl、fam-7t-dabcyl、fam-bhq2、cy3-bhq2、cy5-bhq2、joe-bhq1。

24、11.根据项10所述的试剂盒，其中，所述两种以上靶标遗传物质是来自不同生物样本的遗传物质或来自于同一生物样本的不同的遗传物质。

25、12.根据项11所述的试剂盒，其中，在所述两种以上探针分子中，第一探针分子和第二探针分子的结构为fq-poly-7t、fq-poly-7a或fq-poly-7c序列，优选第一探针分子和第二探针同时为fq-poly-7t序列。

26、13.根据项12所述的试剂盒，其中，所述第一探针分子在第一个t和第二个t之间的磷酸二酯键被修饰，所述第二探针分子在第六个t和第七个t之间的磷酸二酯键被修饰，优选被硫代修饰。

27、14.根据项9所述的试剂盒，其中，所述crispr-cas12b相对其野生型发生了e475r+q119f+e758r替换的工程化cas12b；而所述crispr-cas12i为相对其野生型发生了n164y+e176r+k238r+t447r+e563r+e323r+d362r替换的工程化cas12i；其中，所述工程化cas12i如seq id no:7所示，而所述工程化cas12b如seq id no:13所示。

28、本技术还提供了：

29、1.一种对生物样本中存在的两种以上靶标遗传物质同时或依次进行检测的方法，其中，所述方法包括：

30、向所述生物样本中添加两种以上能够分别靶向两种以上所述靶标遗传物质的crispr-cas系统以及与所述crispr-cas系统对应的探针分子；

31、当任意所述crispr-cas系统遇到其靶向的靶标遗传物质时，所述crispr-cas系统中的cas酶能够被其靶向的靶标遗传物质激活从而反式切割其所对应的探针分子；

32、对被反式切割的探针分子显示的荧光信号或显色结果进行检测从而确定在所述生物样本中是否存在所述靶标遗传物质。

33、2.根据项1所述的方法，其中，

34、所述crispr-cas系统包括cas酶或者能够表达cas酶的核酸、以及能够与所述靶标遗传物质特异性结合的向导分子；

35、优选所述两种以上crispr-cas系统选自下组中的两项以上：crispr-cas12i系统、crispr-cas12b系统、crispr-casx系统、crispr-cas12a系统；

36、而所述向导分子为sgrna和/或crrna。

37、3.根据项2所述的方法，其中，

38、所述探针分子为两种以上且分别具有由多个重复核苷酸构成的序列，并且所述探针分子中的重复核苷酸序列在不同位置上的磷酸二酯键被修饰；所述探针分子具有与各自重复核苷酸序列连接的荧光-淬灭基团(fq)；优选所述荧光-淬灭基团选自下组中的两项以上：fam-bhq1、hex-bhq1、rox-bhq2、cy3-cy5、tet-dabcyl、fam-7t-dabcyl、fam-bhq2、cy3-bhq2、cy5-bhq2、joe-bhq1。

39、4.根据项2所述的方法，其中，所述探针分子仅有一种，且为未经修饰的fam-7t-生物素和/或fam-7c-生物素。

40、5.根据项1所述的方法，其中，所述两种以上靶标遗传物质是来自不同生物样本的遗传物质或来自于同一生物样本的不同的遗传物质。

41、6.根据项3所述的方法，其中，所述crispr-cas系统为两种即crispr-cas12i和crispr-cas12b，而所述探针分子为两种即第一探针分子和第二探针分子，且所述第一探针分子和第二探针分子的结构为fq-poly-7t、fq-poly-7a或fq-poly-7c序列，优选所述第一探针分子和第二探针同时为fq-poly-7t序列。

42、7.根据项6所述的方法，其中，所述第一探针分子仅有一个磷酸二酯键未被修饰，其处于第m个核苷酸和第m+1个核苷酸之间，且所述第二探针分子仅有一个磷酸二酯键未被修饰，其处于第n个核苷酸和第n+1个核苷酸之间，其中m小于n。

43、8.如项7所述的方法，其中，m为选自1-6的整数，而n为选自1-6的整数，其中所述修饰为硫代修饰，优选m为1或2或3，而n为4或5或6。

44、9.根据项6所述的方法，其中，所述crispr-cas12b为相对其野生型发生了e475r+q119f+e758r替换的工程化cas12b；而所述crispr-cas12i为相对其野生型发生了n164y+e176r+k238r+t447r+e563r+e323r+d362r替换的工程化cas12i；其中，所述工程化cas12i如seq id no:7所示，而所述工程化cas12b如seq id no:13所示。

45、10.一种针对生物样本所携带的两种以上靶标遗传物质对生物样本同时或依次进行检测的试剂盒，其中，

46、所述试剂盒包括两种以上靶向所述靶标遗传物质的crispr-cas系统以及在所述crispr-cas系统被所述靶标遗传物质激活后能够被所述crispr-cas系统反式切割并发出荧光信号的探针分子。

47、11.根据项10所述的试剂盒，其中，

48、所述crispr-cas系统包括cas酶或者能够表达cas酶的核酸、以及能够与所述靶标遗传物质特异性结合的向导分子；

49、优选所述两种以上crispr-cas系统选自下组中的两项以上：crispr-cas12i系统、crispr-cas12b系统、crispr-casx系统、crispr-cas12a系统；

50、而所述向导分子为sgrna和/或crrna。

51、12.根据项11所述的试剂盒，其中，

52、所述探针分子为两种以上且分别具有由多个重复核苷酸构成的序列，并且所述探针分子中的重复核苷酸序列在不同位置上的磷酸二酯键被修饰；所述探针分子具有与各自重复核苷酸序列连接的荧光-淬灭基团(fq)；优选所述荧光-淬灭基团选自下组中的两项以上：fam-bhq1、hex-bhq1、rox-bhq2、cy3-cy5、tet-dabcyl、fam-7t-dabcyl、fam-bhq2、cy3-bhq2、cy5-bhq2、joe-bhq1。

53、13.根据项11所述的试剂盒，其中，所述探针分子仅有一种，且为未经修饰的fam-7t-生物素和/或fam-7c-生物素。

54、14.根据项10所述的试剂盒，其中，所述两种以上靶标遗传物质是来自不同生物样本的遗传物质或来自于同一生物样本的不同的遗传物质。

55、15.根据项12所述的试剂盒，其中，所述crispr-cas系统为两种即crispr-cas12i和crispr-cas12b，而所述探针分子为两种即第一探针分子和第二探针分子，且所述第一探针分子和第二探针分子的结构为fq-poly-7t、fq-poly-7a或fq-poly-7c序列，优选第一探针分子和第二探针同时为fq-poly-7t序列。

56、16.根据项15所述的试剂盒，其中，所述第一探针分子仅有一个磷酸二酯键未被修饰，其处于第m个核苷酸和第m+1个核苷酸之间，且所述第二探针分子仅有一个磷酸二酯键未被修饰，其处于第n个核苷酸和第n+1个核苷酸之间，其中m小于n。

57、17.如项16的试剂盒，其中，m为选自1-6的整数，而n为选自1-6的整数，其中所述修饰为硫代修饰，优选m为1或2或3，而n为4或5或6。

58、18.根据项15所述的试剂盒，其中，所述crispr-cas12b相对其野生型发生了e475r+q119f+e758r替换的工程化cas12b；而所述crispr-cas12i为相对其野生型发生了n164y+e176r+k238r+t447r+e563r+e323r+d362r替换的工程化cas12i；其中，所述工程化cas12i如seq id no:7所示，而所述工程化cas12b如seq id no:13所示。

59、本技术的技术方案实现的有益技术效果

60、提供了一种基于不同cas12家族蛋白的多重核酸检测方法，能够特异性检测dna、rna。基于cas12核酸酶对于不同的修饰探针切割的偏好性建立的多重靶标的检测平台技术。该技术能够提供快速简便的dna或者rna检测和分型方法，适用于传染病筛查、基因分型和检测、遗传诊断、医药健康、农业、化工业等各领域应用。同时也适用于多种应用场景，尤其是一管法双重检测体系，可以应用在有一些小型仪器的医院中，进行病原体分型，能够灵敏特异的对毒株进行序列分析；试纸和可视化检测体系更适用于家庭、海关等场景的检测中，同样具有较好的灵敏度，虽然不能一管检测多个靶标，但是分管检测有更好的准确度，操作更为便携。