一种CRISPR-Cas9工程噬菌粒的构建方法与流程

本发明属于微生物的，特别涉及一种crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法。

背景技术：

1、crispr-cas系统是原核生物的一种天然免疫系统。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的dna里一个称为crispr的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的dna切断而使之失效。

2、研究微生物组不仅表明了某些物种对人体健康的重要性，而且还揭示了传统抗菌药物缺乏杀灭特异性的不足。抗生素的使用促进了抗生素耐药性(antimicrobialresistance，amr)的出现，迫切需要开发针对物种的选择性抗生素，以用于操纵复杂的微生物群落。crispr-cas是一种在许多原核生物中发现的适应性免疫系统，可设计用于靶向细菌基因组，导致细胞死亡。

3、基于原核生物的获得性免疫系统研发出的crispr-cas9技术只包含两种重要的成分，一种是行使dna双链切割功能的cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的sgrna(singleguide rna)。当细胞内同时表达sgrna和cas9蛋白时，cas9蛋白通过与sgrna结合，靶向到目的dna序列上发挥dna双链切割的功能。dna序列被切割产生断裂后，引发细胞内部的dna修复机制(dna repair)。当细菌受到噬菌体的侵染时，被释放到细菌细胞质中的噬菌体基因组的某段dna序列被识别并整合到crispr的spacer区域，随后转录出相应的crrna前体(pre-crrna)。crrna前体经过修饰和加工，生成向导rna(guide-rna)。由于grna中存在一段来源于噬菌体基因组的序列，因此grna可以通过碱基的互补配对原则识别噬菌体的基因组，同时存在于细胞质中的grna和cas蛋白特异性结合，并靶向到噬菌体基因组参与dna的切割与降解。

4、如专利申请202211652615.3公开了一种适用于深海真菌fs441的crispr/cas9载体及其构建方法和应用。本发明首次利用crispr/cas9系统构建聚酮杂萜类phomeroids新骨架化合物生物合成基因被敲除的重组p._tersafs441菌株，建立了一种高效的适用于深海真菌p._tersafs441的crispr/cas9基因敲除体系，并通过代谢产物分析证实了ctg1506p450基因在phomeroids生物合成过程中的关键作用，从而为p._tersafs441新型聚酮杂萜类化合物phomeroids生物合成机制解析奠定分子生物学基础。

5、然而，该方法是针对深海真菌p._tersafs441的crispr/cas9基因敲除，应用受到很大局限。

技术实现思路

1、基于此，为解决抗生素耐药性肆虐问题，因此本发明的首要目地是提供一种crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，该方法对大肠杆菌puc119噬菌粒进行改造，将pam区域识别的原型间隔序列(即靶点序列)、grna scaffold、cas9核酸酶基因序列整合至puc119，构建crispr-cas9工程噬菌粒，能够有利于crispr-cas9工程噬菌粒的快速准确构建，大大提高了crispr-cas9工程噬菌粒的适应性。

2、本发明的另一个目地在于提供一种crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，该方法通过酶切和同源重组的方法对噬菌粒puc119进行改造，将卡那霉素(kana)抗性基因n20靶点序列、grna和cas9蛋白表达序列整合到puc119中，构建具有靶向消除卡那霉素(kana)抗性基因功能的重组噬菌粒，将其命名为puc-φ：kana。以大肠杆菌puc119原始噬菌粒载体构建的重组噬菌粒能选择性地插入靶点序列从而特异性消除抗生素耐药性基因，pam区域识别的原型间隔序列(即n20靶点序列)的碱基对决定靶向基因的类型，赋予其所在宿主细胞序列特异性消除抗性基因的能力，同时puc119载体上的hindiii、xbai、bamhi酶切位点提供了外源dna的插入位置，将靶点、grna scaffold、cas9核酸酶等crispr-cas9元件通过同源重组插入其中，并对构建完成的工程噬菌粒进行序列特异性抗菌功能探究，有助于验证crispr-cas体系改造工程噬菌体开发特异性抗菌药物的可能性。

3、为实现上述目的，本发明的技术方案为：

4、一种crispr-cas9工程噬菌粒的构建方法，该方法通过大肠杆菌crispr/cas9系统的cas蛋白行使dna双链切割功能，使其能识别kana抗性基因并使其双链断裂，进而消除质粒；首先构建了含kana抗性基因n20靶点序列的puc-kana-1.5k载体，包含pam区域识别的原型间隔序列(即靶点序列)、grna scaffold、cas9基因部分序列等元件；再将剩余部分的cas9基因序列与puc-kana-1.5k载体同源重组，构建了含kana-n20靶点序列、grnascaffold、完整cas9基因序列的重组噬菌粒puc-φ：kana。

5、该质粒可靶向卡那霉素(kana)抗性基因，消除含kana抗性的质粒和细菌基因组，消除质粒带来的kana抗性或靶向敲除基因组中的kana抗性基因导致细菌死亡，为进一步开发工程噬菌体药物药物奠定基础。

6、具体包括如下步骤：

7、s1，puc-φ:kana载体构建；

8、先进行puc-kana-1.5k载体构建，设计靶点n20，并由此搭建puc-φ：kana载体；

9、其中，设计靶点n20为设计crispr靶点即卡那霉素(kana)抗性基因n20序列：gcgacaatctatcgattgta，并结合同源臂序列设计引物puc-kana-f:aacagctatgaccatgattacgcctagtgcgacaatctatcgattgta catcgccgcagcggtttcag。

10、puc-kana-1.5k载体构建具体包括：使用hindiii-hf限制性内切酶和xbai限制性内切酶对puc119质粒载体进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定约3100bp处的条带，与n20靶点接头进行同源重组连接。

11、进一步，puc-kana-1.5k载体构建体系如下：rcutsmart buffer10μl，hindiii-hf4μl，xbai 4μl，puc119质粒载体23μl，ddh2o补足100μl，37℃反应4h。

12、使用引物puc-kana-f和puc-cas1-r(cggtacccggggatcctctagactaaagcttttaaaagagtc)对grna scaffold、cas9基因部分序列进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约1500bp处的条带，反应体系如下：kod fx neo buffer 18.5μl，引物(10um)各0.5μl，模板puc-φ0.5μl，pcr条件：94℃-2min(1cycles)；98℃-20sec，68℃-90sec(35cycles)；68℃-10min，10℃-∞。

13、将酶切后的puc119载体与含n20的puc-kana片段进行同源重组，体系如下：酶切后的puc119载体约63ng，含n20的puc-kana片段约106ng，2×basic assembly mix 5μl，pcr仪50℃反应25min。

14、s2、设计扩增引物进行pcr扩增，获得cas9基因序列剩余部分的pcr扩增产物，获得puc-kana-3.3k片段；

15、具体地说，使用引物puc-kana-f和puc-cas1-r(cggtacccggggatcctctagactaaagcttttaaaagagtc)对grna scaffold、cas9基因部分序列进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约1500bp处的条带，反应体系如下：kod fx neo buffer 18.5μl，引物各0.5μl，模板puc-φ0.5μl，pcr条件：94℃-2min；98℃-20sec，68℃-90sec(35cycles)；68℃-10min，10℃-∞。

16、s3、puc-kana-1.5k载体使用hindiii-hf限制性内切酶和bamhi-hf限制性内切酶进行酶切，cas9基因序列的pcr扩增产物进行凝胶电泳胶回收，然后将puc-kana-1.5k载体和puc-kana-3.3k片段进行同源重组，获得含n20靶点的puc-φ：kana质粒载体；

17、使用hindiii-hf限制性内切酶和bamhi-hf限制性内切酶对puc-kana-1.5k载体进行酶切，琼脂糖凝胶电泳回收约5000bp处的条带，体系如下：rcutsmart buffer10μl，hindiii-hf4μl，bamhi-hf 4μl，puc-kana-1.5载体13μl，ddh2o补足100μl，37℃反应4h。

18、进一步，将酶切后的puc119载体与扩增的1.5k片段进行同源重组，体系如下：酶切后的puc119载体约63ng，含n20的puc-kana片段约106ng，2×basic assembly mix 5μl，50℃反应25min。

19、进一步，将酶切后的puc-kana-1.5k载体与puc-kana-3.3k片段进行同源重组，体系如下：酶切后的puc-kana-1.5k载体约99ng，puc-kana-3.3k片段约232ng，2×easygenoassembly mix 5μl，50℃反应30min。

20、s4、制备含pks质粒感受态，使用puc-φ：kana质粒载体转化已制备好的含pks质粒的dh5α感受态，通过crispr将含kana抗性基因pks质粒消除，制得crispr-cas9工程噬菌粒。

21、进一步，同源重组产物转化全式金dh5α感受态，涂布于无菌lb+carb培养基平板上，37℃恒温静置过夜培养。通过菌落pcr、质粒大小检测、酶切鉴定筛选阳性克隆：菌落pcr引物pc1-s-f3、pc2-r，反应体系如下：1×taq pcr master mix(blue)7μl，引物各0.25μl，单克隆菌(溶于15μl水)3μl，pcr条件：95℃-7min(1cycles)；95℃-30sec，60℃-30sec，72℃-1min(35cycles)；72℃-10min，10℃-∞；菌落pcr筛选约1500bp的阳性克隆进行摇菌，使用擎科生物高纯度质粒dna小量提取试剂盒提取质粒，进行质粒大小检测。质粒大小正确的阳性克隆再使用hindiii-hf限制性内切酶进行酶切鉴定，体系如下：rcutsmart buffer2μl，质粒～400ng，hindiii-hf 0.5μl，ddh2o补足20μl，37℃酶切3h。酶切鉴定的阳性克隆，送擎科生物进行测序。

22、进一步，扩增引物如下所示：

23、引物名称引物序列(5’-3’)

24、puc-kana-f aacagctatgaccatgattacgcctagtgcgacaatctatcgattgtacatcgccgcagcggtttcag；

25、puc-cas1-r cggtacccggggatcctctagactaaagcttttaaaagagtc。

26、进一步，各片段基因序列下所示：

27、grna scaffold为：

28、gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc；

29、puc-kana-1.5k中的cas9基因部分序列为：

30、atggataagaaatactcaataggcttagatatcggcacaaatagcgtcggatgggcg

31、gtgatcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacag

32、accgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagac

33、agcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaa

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35、ttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtc

36、atcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactat

37、ctatcatctgcgaaaaaaattggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatc

38、tatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagattt

39、aaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaat

40、caattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattcttt

41、ctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtga

42、gaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaatt

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44、cgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttt

45、tggcagctaagaatttatcagatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatac

46、tgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttag。

47、pcr扩增的puc-kana-1.5k序列为：

48、aacagctatgaccatgattacgcctagtgcgacaatctatcgattgtacatcgccgca

49、gcggtttcaggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatca

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70、agatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctccc

71、ctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttag。

72、所述puc-kana-3.3k片段扩增使用引物pc2-f和puc-cas2-r(tcgagctcggtacccggggatccgtctagattaagaaataatcttc)对剩余部分的cas9基因序列进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳回收约3300bp处的条带，反应体系如下：赛默飞superfi ii pcr预混液10μl，引物各0.5μl，模板pcas质粒1μl，ddh2o补足至20μl；pcr条件：98℃-30sec(1cycles)；98℃-10sec，68℃-10sec，72℃-1min40sec(35cycles)；72℃-18min，4℃-∞。

73、进一步，扩增引物如下所示：

74、pc2-f为：

75、ctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttagttcga

76、puc-cas2-r为：

77、tcgagctcggtacccggggatccgtctagattaagaaataatcttc。

78、进一步，各片段基因序列下所示：

79、扩增的cas9-3.3k序列为：

80、tttttttgaattctctagaaacaatacttaatactatagaatgataacaaaataaact

81、actttttaaaagaattttgtgttataatctatttattattaagtattgggtaatattttt

82、tgtagagatattttgaaaaagaaaaattaaagcatattaaactaatttcggaggtcat

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92、gcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattg

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97、gacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttca

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100、agagtaaatactgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttag。

101、对于puc-φ：kana质粒构建，扩增引物如下所示：

102、pc1-s-f3

103、cgcgagagcgtatgaaacg pc2-r

104、ccaccatatttttttggatcccagtcttttttacgagcaataagcttgtccgaa

105、进一步，各片段基因序列下所示

106、puc-φ：kana质粒载体

107、aacagctatgaccatgattacgcctagtgcgacaatctatcgattgtacatcgccgca

108、gcggtttcaggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatca

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185、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

186、本发明通过大肠杆菌crispr-cas9系统的cas蛋白行使dna双链切割功能，使其能识别kana抗性基因并使其双链断裂，进而消除质粒，能够有利于crispr-cas9工程噬菌粒的快速准确构建，大大提高了crispr-cas9工程噬菌粒的适应性。

187、本发明构建了含kana抗性基因n20靶点序列的puc-kana-1.5k载体，包含pam区域识别的原型间隔序列(即靶点序列)、grna scaffold、cas9基因部分序列等元件；再将剩余部分的cas9基因序列与puc-kana-1.5k载体同源重组，构建了含kana-n20靶点序列、grnascaffold、完整cas9基因序列的重组噬菌粒puc-φ：kana。该质粒可靶向卡那霉素(kana)抗性基因，消除含kana抗性的质粒和细菌基因组，消除质粒带来的kana抗性或靶向敲除基因组中的kana抗性基因导致细菌死亡，为进一步开发工程噬菌体药物奠定基础。