一种2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素的制备方法与流程

本发明涉及荧光染料合成，尤其涉及一种2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素的制备方法。

背景技术：

1、羧基功能化荧光素染料，一般都属于呫吨类骨架，即由一个桥氧键把两个苯环固定在同一个平面上形成，这样的刚性共平面结构，使得其具有长波长（吸收和发射都在可见光区），高摩尔吸光系数和高量子产率的优点，另外，羧基功能化荧光素染料还具有生物相容性好，低毒或无毒，成本较低等优点，被广泛应用于各项生物化学领域，如多肽，蛋白质，核苷酸，寡核苷酸，药物，激素，脂质和其他生物分子的标记和示踪，蛋白质结构特性的研究等方面。但是，羧基功能化荧光素染料的这种特殊结构也使得其具有一定的缺陷，如荧光对ph 敏感，斯托克斯位移小，对样品的散射光敏感，不能消除背景散射光的干扰，在生物体内的生理环境下荧光量子效率急剧下降，对光敏感，抗光漂白能力弱，在强光下荧光衰减明显等，这些缺陷限制了羧基功能化荧光素染料在许多研究领域中的进一步应用。

2、为了改善羧基功能化荧光素染料的光学性能，国内外许多生物化学工作者在荧光素的底环或顶环上引入不同功能的化学基团，对其结构进行修饰以达到不同的功能，kharma 在us 4329461a中公开了氯原子对呫吨骨架上芳香氢的选择性取代可以显著改善荧光素类染料的光物理性质，比如增加荧光素的荧光强度提高荧光量子效率、降低染料pka值，以及染料对ph值敏感度明显酸移。这种相似分子结构的微小改变可以调整分子吸收和发射波长，有助于平行合成不同标记的 dna 或蛋白质，这一特性使含氯荧光素衍生物已在dna 合成和测序中得到广泛应用，例如2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素，其结构式如下所示：

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4、目前国内外合成2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素的方法主要有以下两种：

5、1、直接缩合合成法：其合成路线如下路线一所示，

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7、该路线一是荧光素类荧光染料的最经典合成方法，最早由瑞士化学家 mauriceceresole开发，整个反应过程需要两个连续的 friedel-crafts 型亲电芳香取代反应形成呫吨骨架。该路线以2,4-二氯代间苯二酚苯酚和二氯代偏三酸为原料，在路易斯酸（znbr2）中高温缩合制得。该法的优点是路线简单，但该路线主要缺点是反应条件比较苛刻，一般都需要高温（180 °c）甚至熔融，收率低，一般只有百分之十几，生成5，6位的异构体，这类异构体混合物物理化学性质相似，常规方法很难分离纯化。该方法是采用硅胶柱层析分离方法，该种方法除了成本高之外，更重要的是只能得到克级甚至毫克级的产品，难于工业化的批量制备。

8、2、保护拆分法：xianglong wu对直接缩合合成法做了改进，改进的方法借鉴了羧基荧光素的分离方法，改进的路线如下路线二所示，

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10、路线二采用特戊酰氯或特戊酸酐保护保护芳香环上酚羟基，然后保护后的5，6-hex与二异丙胺成盐，利用两种衍生物异构体的盐在溶剂中溶解度的不同进行拆分，拆分出的盐通过浓氨水脱保护，并用盐酸脱盐得到两种异构体5-hex和6-hex。该法的显著的提高了5-hex和6-hex的收率（5-hex收率为38%），但该方法需要经过保护和脱保护过程，步骤相对繁琐，原子经济性不高。

11、综上，现有的2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素的制备方法收率低且纯化过程繁琐，因此开发出更适合工业化生产的2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素合成方法，降低生产成本就有着十分重要的意义。

技术实现思路

1、本发明提供一种2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素的制备方法，用以解决现有的2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素的制备方法收率低且纯化过程繁琐等技术问题。

2、根据本发明的第一方面，本发明提供一种2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素的制备方法，包括如下步骤：

3、步骤（1）：以2,4-二氯代间苯二酚和二氯代偏三酸为原料，通过环合反应制备得到2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素粗品；

4、步骤（2）：将得到的所述2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素进行纯化，得到2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素纯品；

5、步骤（3）：将得到的所述2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素纯品与有机胺、第三溶剂反应，过滤，滤饼烘干得到5-hex铵盐，过滤后的滤液浓缩，即得到6-hex铵盐；

6、步骤（4）：将得到的所述5-hex铵盐和所述6-hex铵盐各自独立地与酸反应分别得到2',4',5',7'-四氯-5-羧基-4,7-二氯荧光素和2',4',5',7'-四氯-6-羧基-4,7-二氯荧光素。

7、上述方案中，本发明一种2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素(hex)制备方法以2,4-二氯代间苯二酚和二氯代偏三酸为原料，通过直接环合反应直接制得2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素(5,6-hex)，该异构体混合物先通过重结晶纯化，然后再利用两种异构体的铵盐在不同溶剂中的溶解度不同从而达到拆分的目的，分别得到高纯度的2',4',5',7'-四氯-5-羧基-4,7-二氯荧光素(5-hex) 和2',4',5',7'-四氯-6-羧基-4,7-二氯荧光素(6-hex)，此方法具有操作简便、对设备要求低、成本低，设备使用效率高等特点，达到工业化生产应用的要求。

8、进一步地，制备方法包括如下步骤：

9、步骤（1）：以2,4-二氯代间苯二酚和二氯代偏三酸为原料，在第一溶剂和酸化剂的作用下，于120-220℃下反应4-12h；反应结束后，水洗，过滤，即得2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素粗品；

10、步骤（2）：以步骤（1）得到的所述2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素粗品与第二溶剂在60~80℃下热熔60~90min, 待体系中的固体溶解完全后停止加热，降温，静置，过滤，得到2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素纯品；

11、步骤（3）：以步骤（2）得到的所述2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素纯品、有机胺、第三溶剂为原料，在40-80℃下反应8-24h；反应结束后，过滤，滤饼烘干即得5-hex铵盐，过滤后的滤液浓缩，即得到6-hex铵盐；

12、步骤（4）：将步骤（3）得到的所述5-hex铵盐和所述 6-hex铵盐各自独立地与酸、第四溶剂在0-80℃下反应6-24h, 反应结束后，过滤，滤饼烘干即得2',4',5',7'-四氯-5-羧基-4,7-二氯荧光素和2',4',5',7'-四氯-6-羧基-4,7-二氯荧光素。

13、上述方案中，通过将各步骤的反应时间、温度等工艺参数控制在合理的范围值，可以提高各步骤反应的效率和反应产物的纯度。

14、进一步地，所述步骤（3）中，所述有机胺为二甲胺，二乙胺，三乙胺，正丁胺，二异丙胺或二异丙基乙基胺，优选为二异丙胺。

15、上述方案中，通过选定合理类型的有机胺，有利于5-hex铵盐和6-hex铵盐的分离。

16、进一步地，所述第三溶剂为乙腈、四氢呋喃、二氧六环、乙醇、乙酸乙酯、2-甲基四氢呋喃或正己烷，优选为2-甲基四氢呋喃。

17、上述方案中，有机胺与第三溶剂相互协同作用，通过选定合理类型的第三溶剂，更有利于5-hex铵盐和6-hex铵盐的分离。

18、进一步地，所述酸化剂为甲磺酸、三氟甲基磺酸、硫酸、磷酸中的一种，优选为甲磺酸。

19、上述方案中，酸即起到催化作用同时也是反应溶剂，通过选定合理类型的酸，有利于环合反应的进行。

20、进一步地，所述第二溶剂为乙腈、四氢呋喃、二氧六环、n,n- 二甲基甲酰胺或水，优选为乙腈。

21、上述方案中，第二溶剂能够有效溶解2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素粗品中的杂质，通过选定合理种类的第二溶剂，能够提升提纯效率。

22、进一步地，所述酸为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸或三氟乙酸，优选为盐酸。

23、上述方案中，酸能与5-hex铵盐和6-hex铵盐反应生成5-hex和6-hex，从而得到目标产物，通过选定合理种类的酸，有利于反应的进行，更有效地得到5-hex和6-hex产物。

24、进一步地，所述第四溶剂为乙腈、四氢呋喃、二氧六环、n,n- 二甲基甲酰胺或水中的一种或多种，优选为乙腈和水。

25、上述方案中，通过选定合理类型的第四溶剂，有利于铵盐与酸的反应的进行。

26、本发明的有益效果：

27、本发明一种2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素的制备方法以2,4-二氯代间苯二酚苯酚和二氯代偏三酸为原料，直接环合得到2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素，此方法用二氯代偏三酸取代二氯代偏三酸酐，在保证反应收率的情况下，具有成本低（酸的价格远低于酸酐）、操作简便（酸酐不易于保存和投料）、对设备要求低，设备使用效率高等特点，达到工业化生产应用的要求。

28、本发明一种2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素的制备方法步骤（3）通过两种异构体直接在酸性条件下，在不同有机溶剂中的溶解度不同从而达到分离两个异构体的目的，改变了之前通过保护羟基，然后成盐，再脱除保护基的操作，极大降低了分离成本，简化了操作步骤，从而使2',4',5',7'-四氯-5(6)-羧基-4,7-二氯荧光素(hex)工业化生产原子经济性和生产成本显著降低。