蚕丝蛋白双网络水凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及材料，尤其涉及一种蚕丝蛋白双网络水凝胶及其制备方法。

背景技术：

1、蚕丝蛋白主要由丝素蛋白和丝胶蛋白组成，丝素蛋白作为核心结构蛋白占据着蚕丝蛋白含量的70-80％。作为一种天然的蛋白质，丝素蛋白被发现有着良好的生物相容性、生物可吸收性、生物可降解性，在组织工程中具有巨大的应用潜力。研究者们通过设想丝素蛋白的潜在应用，已将丝素蛋白加工成薄膜、微粒、纳米球、纳米纤维基质、粘合剂、凝胶等形式，但是目前大多数的加工方式无法满足实际应用的需求，如直接将丝素蛋白加工成的凝胶有着脆而硬的特点，弹性模量较小，无法直接应用到组织工程中。所以现如今需要一种新的方法调控丝素蛋白的空间结构和结晶度，使其能够真正地得到应用。

2、水凝胶是以水为分散介质的凝胶，因其独特的三维网络结构，能贮存大量水分而不发生溶解，既有着固体的弹性又有着一定的流动性。除此之外，一般的水凝胶细胞毒性低、生物相容性好。所以，水凝胶在组织工程中具有巨大的应用潜力。但是水凝胶的机械强度较低，无法直接作为组织替换和修复的材料。所以人们正在寻找能够提升水凝胶机械强度的方法，而双网络水凝胶就是其中一种。所谓的双网络水凝胶就是通过物理交联或者化学交联的方法构建互相穿插的分子双网络，一个网络保证水凝胶的柔韧性，另一个网络限制水凝胶的变形，从而提升水凝胶的机械强度。目前，双网络水凝胶大多数由两个聚合物互穿网络构成，多种聚合物的引入势必会增加组织工程的风险。

3、丝素蛋白有着巨大的潜力，但是现如今丝素蛋白加工体系的不成熟阻碍了丝素蛋白实际应用；一般水凝胶应用受限于其机械强度。

技术实现思路

1、本发明提供了一种蚕丝蛋白双网络水凝胶及其制备方法，其制得的蚕丝蛋白分子双网络水凝胶，具有材料来源天然、机械强度高，且具有良好的生物弹性、生物兼容性和易加工性。

2、一方面，本发明提供了一种蚕丝蛋白双网络水凝胶的制备方法，所述方法包括如下步骤：

3、s1.制备丝素蛋白冻干粉；

4、s2.采用六氟异丙醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉，生成丝素蛋白氟醇溶液；

5、s3.将所述丝素蛋白氟醇溶液与核黄素水溶液进行混合，得到混合溶液；所述核黄素水溶液的浓度为0.5% mg/ml～1.5%mg/ml、2%mg/ml、5% mg/ml、10%mg/ml中的至少一种，所述丝素蛋白氟醇溶液与所述核黄素水溶液的体积比为5:1.5～5:4；步骤s3包括：

6、s301.用天平称取适量的核黄素，向所述核黄素中加入超纯水，搅拌至溶液混合均匀，得到所述核黄素水溶液；

7、s302. 将第一预设体积的所述核黄素水溶液，分预设添加次数缓慢加入至第二预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件；

8、其中，所述第一预设体积与所述第二预设体积的比值为5：1.5～5：4。

9、s4.将所述混合溶液静置放置，直至所述混合溶液中气泡完全释放；

10、s5.将静置后混合溶液注入模具中，静置形成丝素蛋白水凝胶；

11、s6.采用紫外光源照射所述丝素蛋白水凝胶；

12、s7.采用去离子水置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇，得到蚕丝蛋白双网络水凝胶。

13、可选的，步骤s1包括：

14、s101.制备丝素蛋白水溶液；

15、s102.将所述丝素蛋白水溶液置于-30℃～-5℃的环境中冷冻；

16、s103.将冷冻后丝素蛋白水溶液置于冷冻干燥机中进行真空冷冻处理，得到所述丝素蛋白冻干粉；其中，真空冷冻的时间为5h～8h，真空冷冻的温度为-20℃～-5℃，真空冷冻的压强为0.005mbar～0.8mbar。

17、可选的，步骤s101包括：

18、s1011.称取干燥洁净的蚕茧置于碳酸钠溶液中，进行加热处理，除去所述蚕茧的丝胶蛋白进行脱胶，形成蚕丝；

19、s1012.将所述蚕丝置于超纯水中，进行多次洗涤；

20、s1013.将洗涤后的蚕丝进行干燥处理，并将干燥后的蚕丝与锂盐水溶液搅拌混合均匀，保温一段时间，得到丝素蛋白锂盐水溶液；

21、s1014.将所述丝素蛋白锂盐水溶液倒入透析袋中，置于超纯水中透析；

22、s1015.将透析后的丝素蛋白锂盐水溶液转移至离心管中，进行离心处理，收集离心后的上层清液，得到所述丝素蛋白水溶液。

23、可选的，步骤s1011中，所述蚕茧为去除蚕蛹后的蚕茧；所述蚕茧的形状为长方形或者正方形，所述蚕茧的面积为1 mm2～1000mm2；所述碳酸钠溶液的浓度为20 g/l～80g/l，所述蚕茧的质量与所述碳酸钠溶液的体积比为（1：2 ）g/l。

24、可选的，步骤s1011中，所述碳酸钠溶液的加热方式为电炉加热或高压锅加热，加热温度为60℃～100℃，加热压强为0.5mpa～1mpa，加热时间为1s～1000h；所述蚕丝中丝素蛋白的平均分子量由加热时长控制，所述丝素蛋白的平均分子量为10kda～300kda。

25、可选的，步骤s1012中，所述蚕丝的洗涤方式为搅拌洗涤或静置浸泡，其中，搅拌洗涤的搅拌方式为机械搅拌或磁力搅拌，磁力搅拌速度为1 r/min～2000r/min；单次洗涤过程中，所述蚕丝与所述超纯水的质量比为1:20～1:50，时间为60s～5h；每次洗涤后取出所述蚕丝并挤干，重复洗涤次数为1次～50次。

26、可选的，步骤s1013中，所述干燥处理的干燥方式为自然风干或加热通风干燥，所述加热通风干燥的温度为50℃～70℃，干燥时间为1h～5h。

27、可选的，步骤s1013中，所述锂盐水溶液为硫氰酸锂溶液或溴化锂溶液，所述锂盐水溶液的浓度为0.01g/ml～2g/ml，干燥后的蚕丝的质量与所述锂盐水溶液的体积比为(1～100)：100g/ml；保温温度为30℃～50℃，保温时间为0.5h～5h。

28、可选的，步骤s1014中，所述透析袋的规格为10da～10000000da，透析方式为静置透析或磁力搅拌透析；其中，所述磁力搅拌透析的搅拌速度为1 r/min～2000r/min，透析过程中换水的时间间隔为0.1h～100h，每次透析所需超纯水的体积为1ml～1000l。

29、可选的，步骤s1015中，所述离心处理的转速为10 r/min～20000r/min，时间为6s～2h，温度为1℃～5℃。

30、可选的，步骤s2中，所述丝素蛋白冻干粉与所述六氟异丙醇溶液的质量比为1：(1～10)，溶解温度为30℃～50℃，溶解时间为1h～5h，溶解时密封容器。

31、可选的，步骤s302包括：

32、基于所述核黄素水溶液和所述丝素蛋白氟醇溶液在混合过程中所释放的热量对所述蛋白分子的空间结构的改变信息，确定每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔；

33、根据所述第一预设体积和每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积，确定所述核黄素水溶液添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的预设添加次数；

34、基于每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积和相邻两次核黄素水溶液的添加时间间隔，将第一预设体积的所述核黄素水溶液分预设添加次数缓慢加入至第二预设体积的所述丝素蛋白氟醇溶液中，搅拌至混合均匀，以使所述丝素蛋白氟醇溶液中的蛋白分子的空间结构在所述核黄素水溶液的添加过程中的改变满足预设条件。

35、可选的，步骤s302中，所述预设添加次数为2次～40次，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积为1ml～40ml，相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔为30s～1h。

36、可选的，步骤s302中，每次添加至所述丝素蛋白氟醇溶液中的核黄素水溶液的体积随着所述预设添加次数的增加而减小；相邻两次的所述核黄素水溶液的添加时间间隔随着所述预设添加次数的增加而增大。

37、可选的，步骤s302包括：

38、s3021.将所述丝素蛋白氟醇溶液作为当前溶液；

39、s3022.对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入1ml～40ml的所述核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液；

40、s3023.将所述核黄素混合溶液重新作为当前溶液；30s～1h后重复所述对当前溶液进行搅拌，边搅拌边缓慢加入1ml～40ml的所述核黄素水溶液，得到核黄素混合溶液，所述将所述核黄素混合溶液重新作为当前溶液的操作，直至添加次数为2次～40次。

41、可选的，步骤s4中，所述混合溶液静置放置的时间为30min～2h。

42、可选的，步骤s5包括：

43、s501.采用20ml～100ml的医用注射器，将所述静置后混合溶液注入所述模具中；

44、s502.在所述模具中静置形成所述丝素蛋白水凝胶；凝胶化温度为1℃～20℃，时间为0.1h～10h。

45、可选的，步骤s6中：

46、所述紫外光源的波长为长波315nm～380nm、中波280nm～315nm或短波200nm～280nm。

47、可选的，步骤s6包括：

48、s601.采用功率为20w～30w、波长为320nm～330nm的紫外光源，以第一照射距离照射所述丝素蛋白水凝胶0.2h～0.3h；所述第一照射距离为1cm～2cm；

49、s602.采用功率为30w～40w、波长为335nm～345nm的紫外光源，以第二照射距离照射所述丝素蛋白水凝胶0.2h～0.3h；所述第二照射距离为3cm～5cm；

50、s603.采用功率为50w～60w、波长为350nm～380nm的紫外光源，以第三照射距离照射所述丝素蛋白水凝胶0.4h～0.9h；所述第三照射距离为6cm～10cm。

51、可选的，步骤s7包括：

52、s701. 采用温度为70℃～80℃的去离子水，第一次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.2h～0.3h；

53、s703. 采用温度为50℃～60℃的去离子水，第二次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.3h～0.4h；

54、s705.采用温度为10℃～20℃的去离子水，第三次置换所述丝素蛋白水凝胶中的六氟异丙醇0.2h～0.5h，得到蚕丝蛋白双网络水凝胶。

55、另一方面提供了一种蚕丝蛋白双网络水凝胶，所述蚕丝蛋白双网络水凝胶采用如上所述的制备方法制备得到，所述蚕丝蛋白双网络水凝胶的形状为l型、颜色为白色，在7.1mpa的外力下的最大变形量为25.5mm，拉伸伸长率为800%～900%。

56、另一方面提供了一种蚕丝蛋白双网络水凝胶的应用，所述蚕丝蛋白双网络水凝胶采用如上所述的制备方法制备得到，所述蚕丝蛋白双网络水凝胶应用于在鼻部医美整形中进行鼻部的填充和修复。

57、本发明提供的蚕丝蛋白双网络水凝胶及其制备方法，具有如下技术效果：

58、（1）本发明采用丝素蛋白作为水凝胶的主要材料，不仅在生产过程中就减少了有机溶剂的添加，使得操作简单，成分安全，同时蛋白质作为一种天然高分子材料，对人体具有高度亲和性，能够被人体自然吸收，从而大大降低了手术后发生炎症感染的几率，提高了手术的安全性。

59、（2）相比于现存大多数的丝素蛋白材料的制备方法（直接将丝素蛋白水溶液凝胶成型的方法），本发明先将丝素蛋白水溶液制成冻干粉，降低水分子和丝素蛋白分子形成氢键的可能，即表现为分子间β-折叠结构减少，而分子内的β-折叠结构增加，增强了蚕丝蛋白材料本身的机械强度。

60、（3）本发明中六氟异丙醇相比于其他常见溶剂对丝素蛋白的溶解性较高，且六氟异丙醇在溶解丝素蛋白时，不会破坏丝素蛋白的结构；采用六氟异丙醇溶液溶解所述丝素蛋白冻干粉，生成丝素蛋白氟醇溶液；得到的丝素蛋白氟醇溶液与核黄素混合后的混合溶液，能够形成具有优异溶胀性能、生物力学性能、生物相容性的丝素蛋白水凝胶。

61、（4）本发明将丝素蛋白氟醇溶液和核黄素水溶液按体积比5：1.5～5：4混合均匀，使得核黄素加量适中，促进丝素蛋白交联，进一步增加丝素蛋白的β-折叠结构的含量，使其水溶性降低，加速溶液凝胶化；加入核黄素可以形成分子双网络结构，蚕丝蛋白本身的β-折叠网络和氧自由基交联网络，可抑制长时间后β-折叠网络的进一步自发形成，从而避免材料变硬脆；使材料的力学性能更加柔韧、并且能够长期保持其柔韧性；且从溶液转变成凝胶的过程更加快速且可控。

62、（5）本发明通过控制丝素蛋白氟醇溶液与所述核黄素水溶液的体积比，可以使得混合溶液形成丝素蛋白水凝胶的时间小于10h，大大缩短了凝胶成型时间，缩短了蚕丝蛋白分子双网络水凝胶的制备时间，提高了蚕丝蛋白分子双网络水凝胶的生产效率。

63、（6）本发明实施例采用合适、高效的方法（例如，洗涤蚕丝除去可见的蚕茧自带的杂质和na+；透析除去libr；离心除去蚕丝原来的杂质；用甲醇浸泡除去六氟异丙醇；甲醇水溶液浸泡除去甲醇），去除蚕丝中多余的杂质和离子，增加蚕丝蛋白双网络水凝胶的安全性。本发明实施例还可以根据不同的要求调整参数，改变蚕丝蛋白的空间结构，进一步调控蚕丝蛋白双网络水凝胶的强度，满足实际应用的需求（例如，通过加热蚕丝改变丝素蛋白的平均分子质量，进而调整相应的性能，丝素蛋白的平均分子质量越大，材料的韧性就越强）。

64、（7）本发明制得的蚕丝蛋白分子双网络水凝胶，具有材料来源天然、机械强度高，且具有良好的生物弹性、生物兼容性和易加工性等优点，在组织修复和替换中有广阔的应用前景。