改进的FVIII融合蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及重组人凝血因子viii融合蛋白领域，特别涉及一种具有延长的半衰期的融合多肽及其制备方法和应用。

背景技术：

1、a型血友病是由凝血因子viii(fviii)活性的缺乏或功能障碍造成的一种遗传性出血障碍。补充有活性的fviii是治疗a型血友病的有效措施。fviii分子是迄今克隆的最长的基因片段之一，且是应用于临床的分子量最大的蛋白药物。分为6个结构域：三个a结构域(a1、a2、a3)，一个非必需的中央结构域(b-结构域)和两个c结构域(c1、c2)。然而，fviii在体外重组表达量明显低于与其它性质类似的基因，如fviii表达水平只有fix的1％。此外，由于fviii在血液中半衰期较短，仅为8-12小时，严重血友病a患者进行预防性治疗，必须每周静脉内(i.v.)注射约3次。

2、由美国bioverativ公司开发的单体-二聚体杂合体型重组fviii-fc融合蛋白(eloctate)：于2014年6月被美国fda批准上市。临床数据显示，在人体内半衰期延长了仅1.5～1.7倍(dumont j a等,blood,2012,119:3024–3030；powell js等,blood,2012,119:3031-3037)，需每3～5天注射1次。然而，bioverativ公司构建的rfviii fc与fc的双表达载体转染hek-293细胞，在其表达的产物中并未预期检测出rfviiifc同源二聚体形式的融合体，仅表达出单体-二聚体杂合体型rfviiifc融合蛋白和fc二聚体，该公司研究人员推测可能原因是所采用的表达系统因同源二聚体型分子量过大，宿主细胞未能成功分泌分子量约400kda的rfviiifc同源二聚体蛋白，或因rfviiifc单体间的空间位阻效应，而未能发生聚合(peters rt等,j thromb haemost,2013,11(1):132-41)，由此可见，同源二聚体型fviii融合蛋白的表达是相当困难的。

3、对于制备蛋白类药物的长效制剂而言，常规使用具有高溶解度的聚合物(如聚乙二醇(peg))来化学修饰蛋白类药物的表面。一般说来，修饰率越高，蛋白质抗原性降低越明显，活性损失也越大。目前已经报道的聚乙二醇(peg)延长fviii半衰期的有：novonordisk(n8-gp)，bayer(bay94-9027)和baxter(bax 855)公司均开发了peg化的长效fviii产品，并已进入临床研究。然而，药代动力学研究数据显示，peg化的fviii并未获得显著延长的半衰期(tiede a等，j thromb haemost.2013；11:670-678)；(coyle t等，haemophilia.2012；18(suppl 3):22)；(turecek pl等，hamostaseologie，2012，32suppl 1:s29-38)。

4、蛋白药物长效化的实现策略包括糖基化改造、peg化、白蛋白融合、转铁蛋白融合、fc融合、xten融合等。已上市的长效药物仅采用上述策略中的一种用于延长半衰期。没有文献报道将两种以上的上述策略进行组合，特别是peg化与融合蛋白的组合，也没有文献报道将两种以上策略能够使半衰期比采用单一策略时进一步延长。

5、血友病患者需要终生输注凝血因子来止血和预防出血，因此，研发人员需要不断地寻求半衰期更长的凝血因子来减少给药次数。另外，如何在延长半衰期的同时保持良好生物学活性是研发人员面临的难题。

技术实现思路

1、发明人经过多年的研究和长期的试验发现，将凝血因子viii与融合伴侣(例如fc段、白蛋白、xten或转铁蛋白)融合，同时结合缀合物(例如聚亚烷基二醇，更例如peg，包括mpeg)修饰的手段，可以有效地提高多肽的体内稳定性，特别是当缀合部分具有支链结构(或者叫分支结构)时，尤其是在缀合部分的分子量还大于等于35kd，例如40kd时，能够显著提高蛋白的体内稳定性，从而完成了本发明。

2、本发明提供如下技术方案：

3、1、一种与聚亚烷基二醇缀合的凝血因子viii融合蛋白，其中凝血因子viii活性部分(fviii)与延长半衰期的融合伴侣直接连接或者以肽连接子间接连接形成所述融合蛋白，以及所述融合蛋白进一步与聚亚烷基二醇相缀合。

4、2、根据实施方案1所述的融合蛋白，其中所述凝血因子viii活性部分源自人，例如全长或截短的人凝血因子viii，例如缺失b区域的人凝血因子viii；所述全长或截短的人凝血因子viii可包含1或更多个氨基酸突变，条件是仍保留其fviii活性；例如所述凝血因子viii活性部分包含seq id no：1或2所示的氨基酸序列，或者与seq id no：1或2所示氨基酸序列具有至少90％、95％或更高的一致性。

5、3、根据实施方案1或2所述的融合蛋白，其中所述融合伴侣为：免疫球蛋白fc片段、白蛋白、转铁蛋白或xten，这些所述融合伴侣例如源自人；优选为igg fc片段；例如所述iggfc片段具有降低的adcc效应和/或cdc效应和/或与fcrn受体增强的结合亲和力；更优选地，所述igg fc片段具有选自以下的氨基酸序列：

6、(i)seq id no：3所示的氨基酸序列；

7、(ii)seq id no：4所示的氨基酸序列；或

8、(iii)seq id no：5所示的氨基酸序列。

9、4、根据实施方案1至3任一项所述的融合蛋白，其中所述聚亚烷基二醇是聚丙二醇或聚乙二醇；所述聚亚烷基二醇可以是末端封端的，例如经烷氧基如甲氧基封端的；和/或所述聚亚烷基二醇是直链的或支链的；优选地所述聚亚烷基二醇是支链的，例如是支链的聚乙二醇，尤其是经甲氧基封端的支链聚乙二醇；所述聚亚烷基二醇的分子量可以是>＝1、>＝10、>＝20、>＝30、>＝40、>＝50、>＝60、>＝70、>＝80、>＝90、>＝100、>＝110、>＝120、>＝130、>＝140、>＝150或>＝160kda，例如是5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100kda，或者以上任意二数值之间的值。

10、5、根据实施方案1至4任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与聚亚烷基二醇的缀合是随机的或定点的，所述缀合位置选自游离氨基、巯基、糖基和/或羧基，优选地游离氨基。

11、6、根据权利要求5所述的融合蛋白，其中使用任意活化酯形式修饰剂实现所述缀合，例如使用选自如下式(1)、(2)或(3)所述修饰剂实现所述缀合：

12、

13、其中，0≤m1≤6，m1优选为5；mpeg表示甲氧基单封端的聚乙二醇基团；

14、

15、其中0≤m2≤6，m2优选为2；0≤m3≤6，m3优选为1；mpeg表示甲氧基单封端的聚乙二醇基团；或

16、

17、其中，0≤m4≤6，m4优选为2；mpeg表示甲氧基单封端的聚乙二醇基团。

18、7、根据实施方案1至6任一项所述的融合蛋白，其中所述凝血因子viii活性部分与所述融合伴侣通过肽连接子连接，所述肽连接子包括柔性肽接头和/或刚性单元，例如可以包括1、2、3、4、5或更多个所述刚性单元。

19、8、根据实施方案7所述的融合蛋白，其中所述柔性肽接头含有2个或更多个选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸残基，

20、优选地，所述柔性肽接头具有序列通式(gs)a(ggs)b(gggs)c(ggggs)d，其中a、b、c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1，

21、更优选地，所述柔性肽接头具有选自下组的序列：

22、(i)gsgggsggggsggggs(seq id no:6)；

23、(ii)gsggggsggggsggggsggggsggggs(seq id no:7)；

24、(iii)ggggsggggsggggsggggs(seq id no:8)；

25、(iv)gsggggsggggsggggsggggsggggsggggsggggs(seq id no:9)；或

26、(v)gggsgggsgggsgggsgggs(seq id no:10)。

27、9、根据实施方案7或8所述的融合蛋白，其中所述刚性单元为人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽，或所述刚性单元与人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽的氨基酸序列具有70％、80％、90％、95％或更高的一致性；所述刚性单元可以包含1个、2个或更多个糖基化位点；

28、优选地，所述刚性单元包含选自以下的氨基酸序列：

29、(i)prfqdsssskapppslpspsrlpgpsdtpilpq(seq id no:11)；

30、(ii)sssskapppslpspsrlpgpsdtpilpq(seq id no:12)；

31、(iii)sssskappps(seq id no:13)；或

32、(iv)srlpgpsdtpilpq(seq id no:14)；

33、更优选地，所述肽连接子包含seq id no:15所示的氨基酸序列。

34、10、一种药物组合物，其包含有效量的实施方案1至9中任一项所述的融合蛋白，及药学上可接受的载体。

35、11、一种预防和/或治疗出血性疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用实施方案1至9中任一项所述的融合蛋白或实施方案10所述的药物组合物，所述出血性疾病优选地选自fviii先天性或获得性缺乏症患者的出血性疾病和血友病a患者的自发或手术性出血。

36、12、一种改良凝血因子viii的半衰期的方法，其中将凝血因子viii活性部分与增加半衰期的融合伴侣直接连接或者以肽连接子间接连接，并进一步与聚亚烷基二醇相缀合。

37、13.根据实施方案12的方法，其中所述融合伴侣为：免疫球蛋白fc片段、白蛋白、xten或转铁蛋白，这些所述融合伴侣例如源自人；优选为igg fc片段；例如所述igg fc片段具有降低的adcc效应和/或cdc效应和/或与fcrn受体增强的结合亲和力；更优选地，所述igg fc片段具有选自以下的氨基酸序列：

38、(i)seq id no：3所示的氨基酸序列；

39、(ii)seq id no：4所示的氨基酸序列；或

40、(iii)seq id no：5所示的氨基酸序列。

41、14.根据实施方案12或13所述的方法，其中所述聚亚烷基二醇是聚丙二醇或聚乙二醇；所述聚亚烷基二醇可以是末端封端的，例如经烷氧基如甲氧基封端的；和/或所述聚亚烷基二醇是直链的或支链的；优选地所述聚亚烷基二醇是支链的，例如是支链的聚乙二醇，尤其是经甲氧基封端的支链聚乙二醇；所述聚亚烷基二醇的分子量可以是>＝1、>＝10、>＝20、>＝30、>＝40、>＝50、>＝60、>＝70、>＝80、>＝90、>＝100、>＝110、>＝120、>＝130、>＝140、>＝150或>＝160kda，例如是5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100kda，或者以上任意二数值之间的值。

42、15.根据实施方案12至14中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白与聚亚烷基二醇相缀合是随机的或定点的，所述缀合位置选自游离氨基、巯基、糖基和/或羧基，例如游离氨基。

43、16.根据实施方案12至15中任一项所述的方法，其中使用修饰剂实现所述缀合，优选地，所述修饰剂可以是活化酯形式的修饰剂，更优选地，修饰剂选自如下式(1)、(2)或(3)：

44、

45、其中，0≤m1≤6，m1优选为5；mpeg-表示甲氧基单封端的聚乙二醇基团，式(1)所示的修饰剂的分子量为5kd至60kd之间；

46、

47、其中0≤m2≤6，m2优选为2；0≤m3≤6，m3优选为1；mpeg-表示甲氧基单封端的聚乙二醇基团，式(2)所示的修饰剂的分子量为5kd-100kd，优选为40kd、50kd、60kd，最优选为40kd；

48、

49、其中，0≤m4≤6，m4优选为2；mpeg-表示甲氧基单封端的聚乙二醇基团，式(3)所示的修饰剂的分子量为5kd-100kd。

50、17、根据实施方案12至16任一项所述的方法，其中所述凝血因子viii与所述融合伴侣通过肽连接子连接，所述肽连接子包括柔性肽接头和/或刚性单元，例如可以包括1、2、3、4、5或更多个所述刚性单元。

51、18、根据实施方案17所述的方法，其中所述柔性肽接头含有2个或更多个选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸残基，

52、优选地，所述柔性肽接头具有序列通式(gs)a(ggs)b(gggs)c(ggggs)d，其中a、b、c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1，

53、更优选地，所述柔性肽接头具有选自下组的序列：

54、(i)gsgggsggggsggggs(seq id no:6)；

55、(ii)gsggggsggggsggggsggggsggggs(seq id no:7)；

56、(iii)ggggsggggsggggsggggs(seq id no:8)；

57、(iv)gsggggsggggsggggsggggsggggsggggsggggs(seq id no:9)；或

58、(v)gggsgggsgggsgggsgggs(seq id no:10)。

59、19、根据实施方案17或18所述的融合蛋白，其中所述刚性单元为人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽，或所述刚性单元与人绒毛膜促性腺激素β亚基的羧基末端肽的氨基酸序列具有70％、80％、90％、95％或更高的一致性；所述刚性单元可以包含1个、2个或更多个糖基化位点；

60、优选地，所述刚性单元包含选自以下的氨基酸序列：

61、(i)prfqdsssskapppslpspsrlpgpsdtpilpq(seq id no:11)；

62、(ii)sssskapppslpspsrlpgpsdtpilpq(seq id no:12)；

63、(iii)sssskappps(seq id no:13)；或

64、(iv)srlpgpsdtpilpq(seq id no:14)；

65、更优选地，所述肽连接子包含seq id no:15所示的氨基酸序列。