苦木叶中糖苷类化合物及其制备方法和应用

：本发明属于医药，主要涉及苦木叶中糖苷类化合物及其制备方法和应用。具体涉及从药用植物苦木干燥叶中分离得到的八个糖苷类化合物。

背景技术

0、
背景技术：

1、苦木(picrasma quassioides benn)，来源于苦木科，苦木属，是一种主要分布在中国南方的落叶灌木或小乔木，中文名俗称苦皮树，苦木是一种民间常用的清热解毒药物。苦木性寒，味苦，归肺经，大肠经，有清热解毒，燥湿杀虫等功能，主要用于治疗上呼吸道感染，肺炎，急性胃肠炎，痢疾，胆道传染，疮疖，疥癣，湿疹，水火烫伤，毒蛇咬伤等疾病。

2、当代药理研究表明，苦木具有抗菌消炎，解热降压，抗癌抗蛇毒，抗疟降低转氨酶等作用。而目前针对苦木的研究主要集中于苦木的茎皮，因此，对苦木叶中化学成分的研究十分重要。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供了苦木叶中具有新颖结构的8个糖苷类化合物及其制备方法和在制备胆碱酯酶抑制剂方面的应用。

2、为了达到本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：

3、在第一个方面中，本发明提供了8个从苦木科苦木属植物苦木的干燥叶(picrasmaquassioidesbenn)中分离得到的糖苷类化合物，其结构如下所示：

4、

5、在第二个方面中，本发明提供了上述糖苷类化合物的制备方法，包括如下步骤：

6、以苦木叶干燥药材为原料，以体积分数70％乙醇提取，浓缩得到浸膏状乙醇提取物，再用二氯甲烷和正丁醇进行萃取，并经多种色谱手段进行分离纯化。具体通过以下步骤实现：

7、1、取干燥的苦木叶药材，用70％的乙醇回流4次。

8、2、浓缩得到浸膏状乙醇提取物，再用二氯甲烷和正丁醇进行萃取，得到粗提物。

9、3、将二氯甲烷提取物和正丁醇提取物在硅胶柱色谱上进行分离，得到六个馏分fr.a-f。

10、4、馏分fr.e经聚酰胺色谱柱，以乙醇-水系统20：80-90：10进行梯度洗脱，经hp-20柱色谱以乙醇-水系统10:90-90:10梯度进行洗脱，ods柱色谱以乙醇-水系统20:80-80:20系统洗脱，硅胶柱色谱以二氯-甲醇系统80：20-10：90洗脱，共得6个组分即fr.e1-fr.e6。

11、5、所得组分fr.e5在制备性反相高效液相色谱上使用乙腈-水的流动相来分离，得到了化合物1-8。

12、优选地，所述制备方法使用的苦木叶为苦木科苦木属植物苦木干燥叶[picrasmaquassioidesbenn]。

13、所得化合物经过系统结构鉴定结果如下，相应谱图和数据如图1-图27和表1-表3所示。

14、利用多种波谱技术对化合物1-8的结构鉴定。

15、化合物1：

16、无色油状(甲醇)，易溶于二氯甲烷，甲醇等溶剂。高分辨质谱hresims给出准分子离子峰[m+na]+峰m/z481.1357(calcdforc20h26o12na,481.1316)，确定其分子式为c20h26o12。

17、化合物1的1h-nmr谱低场区显示一对间位偶合的苯环质子信号δh7.28(1h,d,j＝1.3hz)，7.17(1h,d,j＝1.3hz)，提示结构中存在1,3,4,5-取代的苯环；δh6.04(2h,s)为亚甲二氧基的特征性质子信号；两个甲氧基质子信号δh3.71(3h,s)，3.91(3h,s)；在高场区还存在三个甲基信号δh1.47(3h,s)，1.51(3h,s)。13c-nmr谱共显示20根碳信号，其中，δc166.1,175.9为羰基碳信号；芳香区共有6个碳信号，δc104.0,110.3,124.4,139.7,143.5,148.9；δc102.7为亚甲二氧基的碳信号；此外，1h和13cnmr数据在δh4.42(1h,d,j＝7.2hz)和δc97.7处显示出葡萄糖部分的特征信号。hmbc光谱中h-7与c-4，c-3的相关性表明-och2o-连接在c-3和c-4上。通过从h-1′到c-1″的hmbc相关证实了在c-1″连接与葡萄糖的c-1′相连。因此，证明化合物1为具有1,3,4,5四取代苯环的糖苷。

18、将化合物1(2mg)在1mhcl(4ml)中加热4小时，并用等体积水饱和的乙酸乙酯萃取三次。干燥水层后，使用吡啶作为溶剂，通过水解获得的糖，l，d-葡萄糖标准品用l-半胱氨酸甲酯盐酸盐和氰基硫酸盐衍生，加热1小时。通过hplc分析混合物，通过标准品衍生物进行比较，化合物1的糖部分被鉴定为d-葡萄糖(tr＝5.5分钟)。根据端基碳的耦合常数(j＝7.2hz)证实了d-葡萄糖的β构型。

19、化合物2：

20、无色油状(甲醇)，易溶于二氯甲烷，甲醇，乙醇等溶剂。高分辨质谱hresims给出准分子离子峰[m+na]+峰m/z423.1269(calcdforc18h24o10na,423.1262)，确定其分子式为c18h24o10。

21、比较化合物2和化合物1的1hnmr和13cnmr核磁共振数据表明，化合物2与化合物1具有相似的结构，化合物2在低场区存在四个氢信号δh6.98(1h,m)，6.97(1h,m)，7.53(1h,m)，7.85(1h,dd,j＝7.93,1.6hz)，表明化合物1中的1,3,4,5四取代苯环被1,2-二取代的苯环取代。根据1h-1hcosy谱，h-3与h-4，h-4与h-5，h-5与h-6的相关证实了以上的论述。根据端基质子δh4.55(1h,d,j＝7.7hz)，确定葡萄糖的相对构型为β。与化合物1相同，化合物2的葡萄糖构型被确定为d构型。

22、化合物3：

23、无色油状(甲醇)，易溶于二氯甲烷，甲醇，乙醇等溶剂。高分辨质谱hresims给出准分子离子峰[m+na]+峰m/z423.1372(calcdforc18h24o10na,423.1362)，确定其分子式为c18h24o10。

24、化合物3的1dnmr与化合物2相似，均为单苯环糖苷，两者的区别在于苯环上羟基的位置从c-2移到了c-4，这可由h-2，h-6(δh7.83)到c-4(δc162.2)的明显的hmbc相关推断出来的。因此，确定了3的结构。根据端基质子在δh4.40处的大耦合常数值(1h,d,j＝7.7hz)，通过与化合物1相同的方法将葡萄糖的相对构型确定为β，将葡萄糖的绝对构型确定为d构型。

25、化合物4：

26、无色油状(甲醇)，易溶于二氯甲烷，甲醇，乙醇等溶剂。高分辨质谱hresims给出准分子离子峰[m+na]+峰m/z453.1377(calcdforc19h26o11na,453.1367)，确定其分子式为c19h26o11。

27、化合物4的1dnmr谱与化合物2和3的nmr谱有很高的相似性。与化合物2和3的13cnmr数据相比，化合物4在δc52.2处明显有一个额外的甲氧基信号。观察hmbc光谱,通过3-och3与c-3的相关确定了3-och3的位置。因此，确定了4的结构。根据δh4.41(1h,d,j＝7.7hz)处端基质子信号的耦合常数，通过酸水解和hplc分析确定了其葡萄糖构型为β,d-葡萄糖。

28、化合物5：

29、无色油状(甲醇)，易溶于二氯甲烷，甲醇，乙醇等溶剂。高分辨质谱hresims给出准分子离子峰[m+na]+峰m/z509.1641(calcdforc22h30o12na,509.1629)，确定其分子式为c22h30o12。

30、化合物5的1dnmr谱显示，化合物5与化合物1-4具有相同的糖苷片段，此外，观察化合物5的1hnmr可以发现其具有1组1,3,4,5-四取代苯环上的氢信号δh7.02(2h,s)，1组烯烃信号δh6.50(1h,d,j＝15.2hz)，7.57(1h,d,j＝15.2hz)，3个甲氧基信号δh3.59(3h,s)，3.80(6h,s)，和2组甲基信号δh1.38(3h,s),1.39(3h,s)。13c-nmr谱显示出22根碳信号，包括6个芳族碳δc148.6,148.6,138.3,124.3,105.9,2个烯属碳δc145.1,114.4,2个羰基碳δc173.9,166.5,3个甲氧基碳δc56.1,56.1,51.8,2个甲基碳信号δc25.0,23.8和1个季碳信号δc76.8，化合物的准确结构由二维谱图证实。根据hmbc谱，h-7、h-8与c-9相关，h-8与c-1相关、h-7与c-2、c-6相关，h-6′与c-9的相关表明糖苷和苯环片段通过α,β-不饱和酮片段连接在一起。根据h-7(δh7.57,d,j＝15.8hz)和h-8(δh6.50,d,j＝15.8hz)的耦合常数，可以确定化合物5中烯烃的构型为反式。葡萄糖相对构型推测为β(δh4.40处的端基质子信号(1h，d，j＝7.7hz))，通过糖苷水解实验和hplc分析确定了5的绝对构型，其糖苷片段确定为β,d-葡萄糖。

31、化合物6：

32、无色油状(甲醇)，易溶于二氯甲烷，甲醇等溶剂。hresims谱给出准分子离子峰[m+na]+峰m/z479.1533(calcdforc21h18o11na,479.1524)，结合氢谱碳谱，确定其分子式为c21h18o11。

33、化合物6的nmr数据与化合物5的数据高度相似，观察其1dnmr可以发现，化合物6与化合物5的差异主要为化合物6缺少了一个甲氧基。这种差异得到了δh3.62(2h,m,h-5)与δc147.8(c-3)和122.8(c-6)的hmbc相关性的支持。与化合物5一样，化合物6的烯烃位置构型也由h-7和h-8的偶联常数决定，鉴定为反式，糖苷片段确定为β,d-葡萄糖。

34、化合物7:

35、白色无定形粉末(甲醇)，易溶于二氯甲烷，甲醇，乙醇等溶剂。高分辨质谱hresims给出准分子离子峰[m+na]+峰m/z657.2194(calcdfor657.2154,c31h38o14na)，确定其分子式为c31h38o14。

36、比较化合物7和1-6的1dnmr谱表明它们具有相似的糖苷片段。7的1hnmr谱显示两个相互耦合的质子δh7.27(1h,d,j＝6.7hz)，7.24(1h,d,j＝6.7hz)，和三个芳香质子δh6.76(2h，s)，6.92(1h，s)，它们归属于1,3,4,5-四取代的苯环和对称的1,3,4-三取代的苯环，两个次甲基质子δh5.54(1h，d，j＝6.7hz)，3.50(1h,m),一个亚甲基质子δh3.72(1h,s)，3.67(1h,d,j＝1.2hz)，和一对反式双键质子δh7.60(1h,d,j＝15.6hz)，6.50(1h,d,j＝15.6hz)。13cnmr数据和hsqc光谱显示化合物7具有两个苯环，两个烯属碳δc132.6,124.1，两个苄基碳δc88.9,50.6，两个氧化亚甲基δc87.9,52.9和两个甲氧基碳δc58.1,56.1。所有这些证据表明化合物7含有苯并二氢呋喃新木脂素。根据h-7′,h-8′与c-9′相关，h-8′与c-4相关，h-7′与c-3,c-5的hmbc谱的相关性表明了c-4与α,β-不饱和酮连接。h-6″与c-9′的hmbc相关表明糖苷片段是通过c-6″与c-9′通过氧原子连在一起的。

37、通过h-7和h2-9之间的noe相关证实化合物7为反式构型。化合物7的绝对构型是通过ecd分析确定的，根据其ecd光谱中270nm处观察到的负cotton效应确定了7的绝对构型为7r,8s，通过δh4.40处的端基质子信号(1h,d,j＝7.7hz)，以及糖苷水解实验和hplc分析，糖苷片段被确定为β,d-葡萄糖。

38、化合物8:

39、无色油状(甲醇)，易溶于二氯甲烷，甲醇，乙醇等溶剂。高分辨质谱hresims给出准分子离子峰[m+na]+峰m/z543.1493(calcdforc25h28o12na,543.1473)，确定其分子式为c25h28o12。

40、比较化合物8和化合物7的1dnmr数据，表明化合物8是一种苯并二氢呋喃木脂素。化合物8的1hnmr光谱显示在的一组1,3,4,5-取代的苯环δh7.46(1h,s)，7.59(1h,s)，一个对称的1,3,4-三取代的苯环δh6.89(2h,s)，6.93(1h,s)，一个低场信号δh6.00(2h,d,j＝2.3hz)，两个次甲基质子δh5.73(1h,d,j＝5.5hz)，3.67(1h,m),还有一个亚甲基质子δh4.09(1h，dd，j＝8.9,5.0hz)，3.67(1h，m)。13cnmr和hsqc光谱显示化合物8具有两个苯环，两个苄基碳δc88.9、50.6，两个氧化亚甲基δc87.9、52.9和两个甲氧基碳δc55.8、51.6，以及亚甲二氧基信号δc101.9。1h和13cnmr数据显示葡萄糖基部分在δh4.42和δc97.7处的特征信号。葡萄糖在δc4.51的端基质子与c-9的hmbc相关表明葡萄糖单元连接在c-9。还通过h-10与c-3，c-4的hmbc相关性确定了亚甲二氧基的位置。根据noesy谱关(h-7与h2-9相关)，化合物8在c-7和c-8位的相对构型化学确定为反式构型。基于二氢苯并呋喃发色团的p/m螺旋规则，在270nm附近的负cotton效应(ce)证明了c-7的r-构型和c-8的s-构型。在酸水解时，确定了化合物8为d-葡萄糖。葡萄糖的β构型是由其端基质子大的耦合常数(7.8hz)决定的，因此确定了化合物8中的葡萄糖为β,d-葡萄糖。

41、本发明的优点在于，所述的化合物都为新化合物，结构新颖具有进一步开发的价值。

42、

43、

44、

45、

46、在第三个方面中，本发明提供了一种药物组合物，包含上述第一个方面所述的糖苷类化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。

47、在第四个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的糖苷类化合物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。

48、对本发明所述8个糖苷类化合物的乙酰胆碱酯酶抑制活性进行了考察，化合物6显示出相对较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性。

49、本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

50、1、本发明相对于现有技术可以快速从苦木叶中分离得到糖苷类化合物。

51、2、本发明可以测定糖苷类化合物的乙酰胆碱酯酶活性。