一种高效的消化道肿瘤类器官培养方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种高效的消化道肿瘤类器官培养方法。

背景技术：

1、肿瘤类器官是从患者肿瘤组织中分离癌细胞并通过特定的生长因子组合在3d基质条件下构建形成的具有一定组织特征的培养物。目前，类器官培养中常规的培养方式为包埋法，即将分散的肿瘤细胞与基质胶进行混合后，以胶滴的形式对细胞团进行培养扩增，但对于消化道肿瘤组织来说，存在以下问题：

2、首先，肿瘤组织的常规的分离方式是基于组织的机械破碎与生物酶消化两种方式或两种方式联合使用。为保证类器官形成以及减少由于消化过度引起的细胞死亡，消化分离的终点，通常以50μm左右的细胞团为最佳。但由于消化过程存在不可控因素，以及肿瘤组织因人而异的组织学特征，通常很难保证消化后产生的是以细胞团为主的混合物。该问题存在于所有类型的肿瘤组织消化中

3、其次，对于消化道肿瘤组织来说，切除部分可能存在正常具有分泌功能的细胞组成，胰蛋白酶、胃蛋白酶的存在可能导致组织细胞过度分散，单细胞以及死细胞的占比高，影响前期类器官的形成。

4、基于此本发明提供了一种高效的消化道肿瘤类器官培养方法，可以有效提高前期的类器官形成数量。

技术实现思路

1、本发明针对目前消化道肿瘤类器官的培养中，可以很明显的观察到在培养前期存在大量的细胞凋亡发生，最终的类器官形成率远低于实际接种细胞的预期情况的问题，提供一种高效的消化道肿瘤类器官培养方法，具体包括以下步骤：

2、步骤一、取新鲜的消化道肿瘤组织，使用pbs清洗后，切碎；

3、步骤二、向组织碎片中加入组织消化液消化，短时多次消化，收集上悬液与细胞/组织沉淀；

4、步骤三、离心收集消化后的细胞/组织沉淀；

5、步骤四、将组织细胞接种至预制的基质胶顶部使用对应的类器官培养基进行培养；

6、步骤五、一段时间后转至胶滴中包埋培养。

7、步骤一所述消化道肿瘤包括胃癌、胰腺癌、结直肠癌中的任意一种；

8、步骤一所述pbs清洗是将获取的肿瘤组织放入离心管中，加入10倍体积的pbs摇晃清洗，并弃去上清；

9、步骤一所述的切碎是将肿瘤组织置于细胞培养皿上用手术刀切碎至0.5mm3的小块。

10、步骤二所述消化是将肿瘤组织碎片置于离心管中，加入至少5倍体积的组织消化液，在恒温摇床中，37℃，200rpm消化处理；

11、步骤二所述短时多次消化是指每次将消化时间控制在3-5分钟，通过自然沉降收集上悬液并加入大比例pbs置冰上终止，补齐消化体系，重复上述步骤，直至组织大部分消化，仅剩少量的组织碎片。

12、步骤三所述的离心收集是将步骤二收集到的上悬液与剩余沉淀一同在4℃、250g条件下离心5分钟，去除上清，获得细胞/组织沉淀。

13、步骤四所述预制的基质胶是将基质胶与dmem（dulbecco's modified eaglemedium）按体积比2:1混合，添加至6孔板中，37℃孵育使凝固，形成一层1mm的凝胶层；

14、步骤四所述的细胞接种是将步骤三收集到的细胞/组织沉淀用对应的含10%基质胶的类器官培养基重悬后，加入预制的基质胶顶部，使其自然分散；

15、步骤四所述的对应的类器官培养基是指胃癌组织使用胃癌类器官培养基，胰腺癌组织使用胰腺癌类器官培养基，结直肠癌组织使用结直肠类器官培养基；

16、步骤四所述的培养是指在37℃、二氧化碳含量5%的环境中进行培养。

17、步骤五所述的一段时间是指3-5天，在六孔板预制的基质胶中培养3-5天，过程中每2-3天进行一次换液。

18、步骤五所述的转至胶滴中包埋是指吸去步骤四的培养上清，每孔加入3mldispase ii（分散酶 ii），用巴斯德滴管将胶滴吹散，于37℃条件下孵育15-20分钟，收集悬液，使用1ml吸头吹打10-20次；4℃、250g条件下离心5分钟，去上清，向细胞沉淀中加入稀释的基质胶混匀，对应的类器官培养基与基质胶的体积比为1:2；按照每滴25-40μl的体积接种至细胞培养板中，37℃待胶滴凝固。

19、步骤五所述的培养是指加入对应的类器官培养基，在37℃、二氧化碳含量5%的环境中进行培养。

20、优选的所述步骤二中的组织消化液包括以下浓度的组分：200-500μg/mlcollagenase ii、10-20μg/ml dnaseⅰ、10-15nmol/mly-27632、1×glutamax和1×penicillin/streptomycin的advance dmem/f12培养基。

21、优选的本发明所述胃癌类器官培养基包括以下浓度的组分：50%（v/v） wnt3a条件培养基、10%（v/v） r-spondin1条件培养基、100ng/ml noggin、10μmol/ml hepes、1×glutamax、1×penicillin/streptomycin、1%（v/v）n2、1%（v/v）b27、10μmol/mlnicotinamide、1μmol/ml n-acetylcystein、50ng/ml human egf、0.01nmol/ml gastrin 1和100 µg/ml plasmocin的advance dmem/f12。

22、优选的本发明所述胰腺癌类器官培养基包括以下浓度的组分：50%（v/v） wnt3a条件培养基、10%（v/v） r-spondin1条件培养基、100ng/ml noggin、10μmol/ml hepes、1×glutamax、1×penicillin/streptomycin、1%（v/v）b-27、10μmol/ml nicotinamide、1μmol/ml n-acetylcystein、0.5nmol/ml a83-01、0.01nmol/mlgastrin 1、100ng/ml fgf10、50ng/ml human egf和25µg/ml plasmocin的advancedmem/f12。

23、优选的本发明所述结直肠癌类器官培养基包括以下浓度的组分：50%（v/v） wnt3a条件培养基、10%（v/v） r-spondin1条件培养基、100ng/ml noggin、10μmol/ml hepes、1×glutamax、1×penicillin/streptomycin、2%（v/v）b27、10μmol/ml nicotinamide、10μmol/ml n-acetylcystein、0.5nmol/ml a83-01、10nmol/mlsb202190、50ng/ml human egf和100µg/ml plasmocin的advance dmem/f12。

24、使用本发明消化道肿瘤类器官培养方法进行胃、胰腺、结直肠在内的消化道肿瘤类器官培养，可以实现前期的细胞自发聚集组织，细胞间的信号传导恢复以及拮抗损伤以及失巢引发的凋亡相关信号通路激活，让更多的细胞活下来，并组装形成类器官，在相同的时间内可以使前期的类器官形成率提高3-5倍及以上。