一种TrkA的抗原表位肽及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种trka的抗原表位肽及其应用。

背景技术：

1、当前临床上使用的用于慢性疼痛治疗的药物主要包括非甾体类抗炎药、抗惊厥药、阿片类药物等，然而这些药物有很多的不足，其中，非甾体抗炎药的疗效有限，并且具有包括消化道出血和肾脏毒性等副作用；而阿片类药物具有成瘾等副作用。ngf/trka作为开发新型镇痛药物的有效靶点，为解决以上难题提供了一种可能。

2、原肌球蛋白受体激酶a(tropomyosin receptor kinase，trka,也称为highaffinity nerve growth factor receptor，neurotrophic tyrosine kinase receptortype 1，或trk1 transforming tyrosine kinase protein)属于原肌球蛋白受体激酶(trk)家族一员。trk受体是跨膜受体，由含配体结合区的胞外区、跨膜区、含酪氨酸激酶区的胞内区组成。trka主要在神经嵴神经元、交感神经神经元以及基底前脑和纹状体的胆碱能神经元中表达，在包括b淋巴细胞在内的一些非神经元组织和细胞中也有表达。

3、神经生长因子(nerve growth factor，ngf)参与疼痛的病理生理过程，主要通过结合trka受体激活ngf/trka信号通路，影响炎症介质的释放、离子通道的开放以及促进神经纤维的生长，从而参与疼痛的发生，传导以及增敏过程。研究表明，阻断ngf-trka信号通路可以有效的缓解疼痛和痛觉过敏，ngf-trka信号通路是开发新型镇痛药物的有效靶点。

4、对于ngf-trka靶点镇痛药物的开发，筛选能够阻断ngf和trka的结合的抗trka单克隆抗体是有效手段之一。通常情况下，可通过全长的trka受体或trka受体的胞外区免疫动物筛选抗trka单克隆抗体，但是筛选得到的抗trka单克隆抗体大多都不能够阻断ngf和trka结合。trka的优势抗原表位的发现能够指导设计合适的免疫原制备能特异性阻断trka受体与其配体ngf结合的抗trka单克隆抗体，提高阻断活性trka单克隆抗体药物发现的效率和成功率。然而，目前仍鲜见相关报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种trka的抗原表位肽及其应用，特异性结合该抗原表位的抗体可以有效阻断trka受体与其配体ngf的结合，抑制或减弱trka所参与的ngf/trka信号传递，从而有效缓解疼痛和痛觉过敏。

2、为此，第一方面，本发明提供一种trka的抗原表位肽，其包含seq id no：4所示的氨基酸序列。

3、在一些实施方案中，所述trka的抗原表位肽的氨基酸序列为seq id no：4。

4、在一些实施方式中，所述trka的抗原表位肽为以seq id no：4为核心区域，且基于trka胞外区的氨基酸序列向seq id no：4的氨基端、羧基端或氨基端和羧基端两端延伸的多肽。

5、其中，所述trka胞外区的氨基酸序列为seq id no：1、seq id no：2、或seq id no：3。

6、在一些实施方式中，所述trka的抗原表位肽为以seq no：4为核心区，且基于seqid no：1、seq id no：2、或seq id no：3向seq id no：4的氨基端、羧基端或氨基端和羧基端两端延伸的多肽。

7、进一步，所述向seq id no：4的氨基端、羧基端或氨基端和羧基端两端延伸的氨基酸的数量各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。

8、在一些实施方式中，所述trka的抗原表位肽为以seq no：4为核心区，且基于seqid no：1、seq id no：2、或seq id no：3向seq id no：4的氨基端延伸m个氨基酸的多肽，所述m选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。

9、在一些实施方式中，所述trka的抗原表位肽为以seq no：4为核心区，且基于seqid no：1、seq id no：2、或seq id no：3向seq id no：4的羧基端延伸n个氨基酸的多肽，所述n选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。

10、在一些实施方式中，所述trka的抗原表位肽为以seq no：4为核心区，且基于seqid no：1、seq id no：2、或seq id no：3向seq id no：4的氨基酸延伸p个氨基酸且向羧基端延q个氨基酸的多肽，所述q和q各自独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。

11、在一些实施方式中，所述trka的抗原表位肽的氨基酸序列为seq id no：5-18任一项所示。

12、本发明的第二方面，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白由本发明所述的抗原表位肽与载体蛋白融合所形成。

13、进一步，所述载体蛋白选自钥孔血蓝蛋白(klh)、牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)、甲状腺球蛋白、人血清白蛋白中的一种。

14、本发明的第三方面，提供一种核酸分子，其编码本发明所述的抗原表位肽或本发明所述的融合蛋白。

15、本发明的第四方面，提供一种载体，其包含本发明所述的核酸分子。

16、本发明的第五方面，提供一种宿主细胞，其表达本发明所述的抗原表位肽，和/或表达本发明所述的融合蛋白，和/或含有本发明所述的核酸分子，和/或含有本发明所述的载体。

17、本发明的第六方面，提供本发明所述的抗原表位肽、和/或本发明所述的融合蛋白、和/或本发明所述的核酸分子、和/或本发明所述的载体、和/或本发明所述的宿主细胞在以下(a)、(b)、(c)、(d)或(e)方面的用途：

18、(a)用于制备抗trka抗体；

19、(b)用于制备针对trka的核酸适配体、疫苗、纳米粒子；

20、(c)用于制备预防和/或治疗与trka相关的疾病的药物；

21、(d)用于制备抑制或减弱trka所参与的信号传递的药物；

22、(e)用于制备镇痛药物。

23、本发明的第七方面，提供一种抗体，其识别并结合本发明所述的抗原表位肽。

24、进一步，所述抗体能够抑制或减弱trka所参与的信号传递。

25、进一步，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，种属来源可以为人、鼠、兔、猴、牛、羊或羊驼等哺乳动物。

26、本发明的第八方面，提供一种抗trka抗体的制备方法，其包括：(1)用本发明所述的抗原表位肽或融合蛋白免疫动物，获得杂交瘤细胞，收集培养上清液；(2)对步骤(1)收集的上清液进行筛选、鉴定和纯化，得到抗trka抗体。

27、本发明的第九方面，提供一种疫苗，其包含本发明所述的抗原表位肽、融合蛋白、核酸分子、载体或者宿主细胞。

28、本发明的第十方面，提供一种组合物，其含有本发明所述的抗原表位肽、融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、抗体或者疫苗，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

29、所述药学上可接受的载体和/或辅料应当与所述抗原表位肽、融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞、抗体、疫苗相容，即能够与其共混而不会大幅降低药物的效果。作为药学上可接受的载体或辅料的一些例子包括：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；等渗盐溶液等。

30、与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

31、(1)本发明通过氢氘交换质谱测定得到trka抗原的优势抗原表位，与其特异性结合的抗trka抗体能够阻断trka受体与其配体ngf结合，且该抗原表位存在于人、小鼠、大鼠和食蟹猴的trka中。

32、(2)本发明提供的抗原表位肽具有免疫原性，其可诱导产生免疫反应，该抗原表位肽或者含有其的融合蛋白可以用来制备抗体、核酸适配体、疫苗、靶向trka的纳米颗粒等，且可以预期制备得到的抗体、核酸适配体、疫苗、靶向trka的纳米颗粒可以有效阻断trka受体与其配体ngf结合，抑制或减弱trka所参与的ngf/trka信号传递，从而有效缓解疼痛和痛觉过敏。