用于敲除T细胞中的TRAC和B2M的试剂和方法与流程

文档序号:35244691发布日期:2023-08-25 10:29阅读:336来源:国知局
用于敲除T细胞中的TRAC和B2M的试剂和方法与流程

本发明涉及t细胞中的 trac和 b2m双重敲除。具体而言,本发明涉及具有较高敲除效率的靶向 trac和 b2m的sgrna序列及其使用方法。


背景技术:

1、截至2021年6月,全球范围内已经上市了五款car-t产品,这五款产品都属于自体car-t疗法,其制备需要采集癌症患者的外周血,分离t细胞,进行基因改造,体外培养后对患者进行回输,属于“量身定制”的个体化治疗方式。自体car-t治疗正在彻底改变癌症治疗的方式和方法,但也存在着一些明显的局限性。首先自体car-t生产周期较长,患者需要较长的等待时间,有些患者可能错过最佳的治疗窗口。其次,自体car-t产品的质量一致性相对较差。患者t细胞状态不一致会影响产品的效能,部分患者面临制备失败的风险,因此并非所有适应症患者都可以接受治疗,总体来说每次制备的细胞数量和质量一致性得不到充分的保证。另外,自体car-t制备受到起始原料的限制,很难进行二次制备和治疗。最后,自体car-t物流复杂,规模效率相对低下,这种个体化治疗导致成本高昂。

2、同种异体car-t,又称通用型car-t(ucar-t)、即用型car-t,是指从健康志愿者体内提取分离t细胞,进行相关改造,制备成car-t细胞,使其既能规避移植后的免疫排斥反应,又能发挥既定的抗癌作用。可以一次性制备、储存大量的car-t细胞,当有患者需要car-t细胞的时候,可以达到“随取随用”的目的。与自体car-t相比,异体car-t能够从库存按需交付产品,更快的治疗时间能够使更多的患者接受治疗并获得潜在的有益结果,同时根据需要可进行多次给药。其次,异体car-t由于采用统一的来自健康志愿者的pbmc,细胞活力和状态更好,质量一致性较好,具有更加可预测的安全性和功效,可以治疗所有适合的患者。最后,异体car-t一次生产即可治疗大批的患者,扩大生产规模可以进一步降低成本,降低药物价格。

3、异体car-t具有的以上优势使其成为car-t细胞治疗领域未来的主要趋势。根据nature杂志统计,血液恶性肿瘤药物最受关注的5个适应症依次是复发难治性nhl(dlbcl、fl、mcl和cll)和mm。如果car-t疗法在实体瘤方面取得重要突破,将使更多患者受益。异体car-t的成功研发,将使car-t细胞免疫治疗成为癌症患者随时能够使用,并且能够用得起的药物,获得巨大的临床和市场应用价值。

4、异体car-t最大的科学障碍在于“移植物抗宿主病(gvhd)”和“宿主抗移植物病(hvgd)”。体内的t细胞通过tcr识别抗原呈递细胞表面hla分子结合的抗原肽,从而杀伤异源细胞。gvhd是由于移植后异体供者移植物中的t淋巴细胞,以受者靶细胞为目标发动细胞毒攻击。hvgd在移植领域指受者对供者组织器官产生的排斥反应,主要是由于在移植物中识别了非自身的hla分子。对于异体car-t来说,即宿主t细胞杀伤供者的t细胞。

5、hvgd与gvhd相关基因包含tcr、hla分子相关基因。这些基因同时敲除的t淋巴细胞在回输入同种异体病人时不会引起移植物抗宿主病(gvhd),因此可以称为“通用型t细胞”。例如,单个 trac基因是编码tcrα链的基因与编码tcrβ的两个 trbc基因形成完整的有功能的tcr复合物。敲除 trac是可以致使tcr失活,而 b2m为mhci相关基因。这两个基因同时敲除的t淋巴细胞在回输入同种异体病人时不会引起hvgd与gvhd。

6、t细胞受体(t cell receptor, tcr)是t细胞表面的特异性受体,负责识别由主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,mhc)所呈递的抗原。t细胞受体是异源二聚体,由两个不同的亚基所构成。95%的t细胞的受体由α亚基(tcrα链- trac基因编码)和β亚基(tcrβ链- trbc基因编码)构成。在t细胞中,t细胞受体(tcr,包含α链和β链)、cd3复合物(包括cd3γ、cd3δ和2个cd3ε链)以及2个ζ链共同形成t细胞受体复合体(又称为tcr-cd3复合物),形成完整的细胞表面抗原受体,行使功能。

7、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,mhc),又称主要组织相容性复合基因,呈高度多态性,其编码产物(主要组织相容性抗原)是抗原提呈和t细胞活化分子,与免疫应答及免疫调节密切相关,也是引起快而强的排斥反应的抗原;其中,人类的mhc糖蛋白,又称为人类白血球抗原(human leukocyte antigen,简称hla)。mhc基因家族分为三个亚群,分别编码三类分子:mhc i类分子、mhc ii类分子、mhc iii类分子。第一类主要组织相容性复合体(mhc i类分子)由一个跨越细胞膜的α链和一个连在这个链上的、细胞外的β2微球蛋白组成。整个分子由四个区组成,其中,三个区位于α链上(α1-α3),β2微球蛋白组成第四个区。在人类中,第一类mhc又称第一型人类白细胞抗原分子,在几乎所有有核细胞表面均有分布。这些分子又可以细分为hla-a、hla-b和hla-c。“β2微球蛋白(b2m)”是细胞表面人白细胞抗原(hla)的β链(轻链)部分。敲除 b2m基因,细胞不表达β2微球蛋白,在细胞表面则不能形成mhc i类分子。

8、现有的同种异体car-t工艺制备规模小,无法满足市场需求。在大规模的细胞分选、大体积的t细胞培养、磁珠去除等方面存在较大缺陷,阻碍了同种异体car-t的工业化生产进度。


技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服异体car-t引起的gvhd和hvgd问题。

2、本发明的技术方案是提供高敲除效率的针对trac(tcrα链)和b2m(hla中β-2-微球蛋白)的sgrna及其使用方法。

3、为了克服异体car-t可能引起的免疫排斥反应,我们采用基因编辑的方法,通过crispr/cas9敲除t细胞中的 trac及 b2m基因,使得t细胞表面无法形成tcr复合物及hla分子,从而避免异体car-t会引起的gvhd和hvgd排斥反应。

4、我们通过筛选高敲除效率的sgrna,获得高纯度的trac/b2m双阴性细胞,提高双阴性细胞的分选效率,为终产品双阴性细胞纯度奠定良好基础。同时,改进细胞分选的方法和工艺,实现从大批量的pbmc中分选t细胞以及从大量基因编辑后的t细胞中分选trac/b2m双阴性细胞。同时,通过中间步骤分选双阴性t细胞,分选后继续培养,降低细胞分选的难度和成本。

5、第一方面,本发明涉及一种sgrna,其靶向 b2m基因,其核苷酸序列如序列1-21任一所示,特别是如序列3、6、9、12、14、15、16、18和19任一所示,尤其是如序列18所示。

6、第二方面,本发明涉及一种sgrna,其靶向 trac基因,其核苷酸序列如序列22-41任一所示,特别是如序列37和41任一所示,尤其是如序列37所示。

7、第三方面,本发明涉及一种sgrna套组,其包含一种或多种本发明第一方面的sgrna和一种或多种本发明第二方面的sgrna。在一个实施方案中,所述sgrna套组包含核苷酸序列如序列18所示的本发明第一方面的sgrna和核苷酸序列如序列37所示的本发明第二方面的sgrna。

8、第四方面,本发明涉及一种生成trac/b2m双阴性t细胞(特别是trac/b2m双阴性car-t细胞)的方法,其包括:使用本发明的sgrna套组处理t细胞,使得其中的 b2m基因和 trac基因敲除。在一个实施方案中,使用sgrna套组处理t细胞通过rnp复合物电转cas9蛋白和所述sgrna套组来进行。在一个实施方案中,每100μl电转体系含2.5~9μg每种sgrna、5~10μg cas9和5.0e+06~2.0e+07个t细胞。在一个实施方案中,每100μl电转体系含5μg每种sgrna、10μg cas9和5.0e+06~2.0e+07个t细胞,例如5.0e+06、7.5e+06、1.0e+07个、1.25e+07、1.5e+07、1.75e+07、或2.0e+07个t细胞。在一个实施方案中,通过电转、慢病毒或aav导入靶向 b2m基因的sgrna、靶向 trac基因的sgrna或sgrna套组。在一个实施方案中,通过电转、慢病毒或aav导入cas9。在一个实施方案中,导入sgrna套组的方式与导入cas9的方式相同。在一个实施方案中,导入sgrna套组的方式与导入cas9的方式不同。在一个实施方案中,导入靶向 b2m基因的sgrna的方式与导入靶向 trac基因的sgrna的方式相同。在一个实施方案中,导入靶向 b2m基因的sgrna的方式与导入靶向 trac基因的grna的方式不同。在一个实施方案中,在用sgrna套组处理t细胞之前或之后,使用编码car多肽的核酸处理t细胞,使得car多肽在t细胞表面表达。在一个实施方案中,使用编码car多肽的核酸处理t细胞通过慢病毒感染来进行。在一个实施方案中,在用sgrna套组处理t细胞之后,分选和/或扩充trac/b2m双阴性细胞。在一个实施方案中,在用sgrna套组处理t细胞之后,在分选trac/b2m双阴性细胞之后扩充trac/b2m双阴性细胞。在一个实施方案中,在用sgrna套组处理t细胞之后,在扩充之后分选trac/b2m双阴性细胞。在一个实施方案中,所述car靶向cd19。在一个实施方案中,所述car靶向il-13ra2。在一个实施方案中,所述car靶向bcma。在一个实施方案中,car包含抗原(例如cd19、il-13ra2或bcma)结合区(例如scfv)、铰链区(例如来自cd8、cd28、igg1或igg4)、跨膜区(例如来自cd28、cd8、cd4或icos)、一个或多个胞内共刺激域(例如来自cd28、4-1bb、icos、cd27或ox40)和胞内信号域(例如来自cd3ξ)。在一个实施方案中,靶向cd19的car由序列42编码。在一个实施方案中,靶向il-13ra2的car由序列43编码。在一个实施方案中,靶向bcma的car由序列44编码。

9、第五方面,本发明涉及通过本发明的方法获得的trac/b2m双阴性t细胞,特别是trac/b2m双阴性car-t细胞。

10、第六方面,本发明涉及一种组合物,其包含通过本发明的方法获得的trac/b2m双阴性t细胞,特别是trac/b2m双阴性car-t细胞。

11、第七方面,本发明涉及一种治疗疾病的方法,其包括:对患者施用通过本发明的方法得到的trac/b2m双阴性car-t细胞。在一个实施方案中,本发明涉及一种治疗b细胞白血病(例如急性b细胞白血病)的方法,其包括:对患者施用通过本发明的方法得到的靶向cd19的trac/b2m双阴性car-t细胞。在一个实施方案中,本发明涉及一种治疗胶质瘤(例如胶质母细胞瘤)的方法,其包括:对患者施用通过本发明的方法得到的靶向il-13ra2的trac/b2m双阴性car-t细胞。在一个实施方案中,本发明涉及一种治疗骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)的方法,其包括:对患者施用通过本发明的方法得到的靶向bcma的trac/b2m双阴性car-t细胞。

12、第八方面,本发明涉及通过本发明的方法得到的trac/b2m双阴性car-t细胞制备药物的用途。

13、在一个实施方案中,通过本发明的方法得到的trac/b2m双阴性car-t细胞可用于治疗恶性血液肿瘤、恶性实体肿瘤或自身免疫性疾病,或用于制备相关药物。在一个实施方案中,所述恶性血液肿瘤是白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征或脊髓发育不良。在一个实施方案中,所述自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮或抗合成酶抗体综合征。在一个实施方案中,所述恶性实体瘤是胶质母细胞瘤、肝癌、胃癌、结直肠癌、黑色素瘤或肺癌。

14、在一个实施方案中,通过本发明的方法得到的靶向cd19的trac/b2m双阴性car-t细胞可用于治疗b细胞白血病(例如急性b细胞白血病),或用于制备相关药物。在一个实施方案中,通过本发明的方法得到的靶向cd19的trac/b2m双阴性car-t细胞可用于治疗恶性血液肿瘤或自身免疫性疾病,或用于制备相关药物。在一个实施方案中,所述恶性血液肿瘤是白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征或脊髓发育不良。在一个实施方案中,所述白血病是急性白血病或慢性白血病。在一个实施方案中,所述急性白血病是急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性粒-单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病或急性红白血病。在一个实施方案中,所述慢性白血病是慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓性白血病或慢性淋巴细胞白血病。在一个实施方案中,所述淋巴瘤是霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。在一个实施方案中,所述自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮或抗合成酶抗体综合征。

15、在一个实施方案中,通过本发明的方法得到的靶向il-13ra2的trac/b2m双阴性car-t细胞可用于治疗胶质瘤(例如胶质母细胞瘤),或用于制备相关的药物。

16、在一个实施方案中,通过本发明的方法得到的靶向bcma的trac/b2m双阴性car-t细胞可用于治疗骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤),或用于制备相关药物。在一个实施方案中,通过本发明的方法得到的靶向bcma的trac/b2m双阴性car-t细胞可用于治疗浆细胞白血病、自身免疫性疾病或视神经脊髓炎谱系疾病,或用于制备相关药物。

17、本发明提供一种试剂盒,其包括一个或多个容器,其中装有分开或任意组合地装有本发明第一方面的sgrna和本发明第二方面的sgrna,以及任选的cas9蛋白。在一个实施方案中,本发明提供一种试剂盒,其包括至少一个容器,其中装有cas9蛋白、本发明第一方面的sgrna和本发明第二方面的sgrna。在一个实施方案中,本发明提供一种试剂盒,其包括至少一个容器,其中装有本发明第一方面的sgrna和本发明第二方面的sgrna。在一个实施方案中,本发明提供一种试剂盒,其包括至少两个容器,其中,第一容器装有cas9蛋白,第二容器装有本发明第一方面的sgrna和本发明第二方面的sgrna。在一个实施方案中,本发明提供一种试剂盒,其包括至少两个容器,其中,第一容器装有cas9蛋白和本发明第一方面的sgrna,第二容器装有cas9蛋白和本发明第二方面的sgrna。在一个实施方案中,本发明提供一种试剂盒,其包括至少两个容器,其中,第一容器装有本发明第一方面的sgrna,第二容器装有本发明第二方面的sgrna。在一个实施方案中,本发明提供一种试剂盒,其包括至少三个容器,其中,第一容器装有cas9蛋白,第二容器装有本发明第一方面的sgrna,第三容器装有本发明第二方面的sgrna。本发明的试剂盒还可以包括说明书,提供关于使用cas9蛋白、本发明第一方面的sgrna和本发明第二方面的sgrna实施本发明生成trac/b2m双阴性car-t细胞的方法的信息。

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