一种玉米根系原生质体制备与转化方法

本发明涉及原生质体制备与转化，尤其是涉及一种玉米根系原生质体制备与转化方法。

背景技术：

1、瞬时转化系统能够吸收外源基因并快速表达，相较于稳定转化其时间更短，效率更高，在解析基因功能方面发挥重要作用，已在多种植物中被广泛应用(张小莉，王鹏程，宋纯鹏.基于基因枪技术的拟南芥瞬时表达转化方法的建立[j].河南大学学报(自然科学版)，2008，(05)：506-509)。其中原生质体介导的瞬时转化体系具备高效率、易操作的特点，且不需要特殊的仪器设备、不依赖于物种并能快速得到结果，使其成为目前应用最广的瞬时转化系统之一(彭小群，王梦龙.水稻遗传转化研究进展[j].中国农学通报，2021，37(27)：1-5)。但由于原生质体细胞保留了源细胞生理活性与调节能力，因此分离与制备不同植物组织的原生质体对于研究组织特异基因的功能至关重要。

2、目前，根系原生质体的制备体系在许多植物中都已建立，不同植物由于根系的差异，制备根系原生质体的酶解液和酶解时间差异较大。研究表明在1％果胶酶、4％纤维素酶r-10、3％纤维素酶rs的条件下，酶解4h后可以分离得到酸枣幼根的原生质体(武延生，邢翠娟，李敏等.酸枣幼根原生质体的制备[j].耕作与栽培，2021，41(01)：25-31)。分离紫花苜蓿原生质体的方法是将清水紫花苜蓿根系在2％纤维素酶、0.5％果胶酶、0.3％崩溃酶中酶解10h，里奥百脉根在2％纤维素酶、0.5％果胶酶、0.3％半纤维素酶中酶解12h会得到较好的原生质体(李玉珠，师尚礼.紫花苜蓿与百脉根原生质体培养及不对称体细胞杂交[j].核农学报，2015，29(01)：40-48)。因此，根据物种根系的特异性制定专一的制备方法十分有必要。

3、目前，玉米中许多重要的功能基因尚不清楚，挖掘玉米中的功能基因并解析其作用机制十分必要。但由于玉米稳定遗传转化周期长、费用昂贵，操作困难，严重阻碍了玉米中重要功能基因的挖掘与研究。

4、公布号为cn 103789252 a的中国发明专利申请公布了一种玉米珠心原生质体的制备和转化方法，该申请是取授粉后6天到8天的玉米珠心组织，高渗处理后酶解，然后再用含0.55m甘露醇的mmg溶液重悬，制得珠心原生质体；最后采用peg诱导转化。本发明操作简单，制备珠心原生质数量大、活性高，原生质细胞转化效率高，为后续基因功能分析，特别是有关细胞程序化死亡机理解析提供有力的技术支持。但该方法仅适用于玉米珠心原生质体的制备。由于材料组织不同，即使在相同制备条件下原生质体的制备效率也会存在差异，因此需要探索玉米根系原生质体制备及转化的最优条件。根系是玉米应对环境变化的重要器官，因此，在玉米根系中开展功能基因的挖掘与机制研究十分必要，开发以玉米根系为介质的瞬时转化系统迫在眉睫，但是至今，国内外还未曾发现有对玉米根系原生质体的制备及转化相关研究报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种玉米根系原生质体制备与转化方法，为挖掘根系相关基因提供一定的技术支持。

2、为了解决现有技术存在的问题，本发明采用的技术方案是：

3、第一个方面，本发明提供一种玉米根系原生质体制备方法，包括以下步骤：

4、(1)选取mo17种子，通过水培的方式获取玉米根系；

5、(2)将玉米根系切成圆柱体，用13-15％(m/v)的甘露醇溶液进行高渗处理；

6、(3)配制酶解液，将经过高渗处理后的玉米根系放入酶解液中，在23-28℃，50-60rpm条件下避光酶解4-8小时；

7、所述酶解液是按照以下方法配制的：按照终浓度为1-2％(m/v)纤维素酶、0.5-0.8％(m/v)离析酶、0.4-0.8m甘露醇、10mm mes补足ddh20至10ml；55℃水浴10min，每隔2min颠倒摇匀一次，然后加入终浓度为10mm cacl2、0.1％(v/v)bsa，用0.45mm滤膜过滤灭菌备用；

8、(4)收集玉米根系原生质体；

9、(5)原生质体活性鉴定。

10、进一步地，所述步骤(1)包括以下步骤：

11、将mo17种子清洗后杀菌；用温水浸泡6-8h使种子吸涨萌动，催芽；待种子破胸后移至海绵中进行水培。采用本步骤可以保证后续水培过程中玉米种子不会霉变，玉米种子能够正常成苗。

12、进一步地，所述步骤(2)包括以下步骤：

13、水培5-9d后，将玉米根系切成1mm长的圆柱体；把切好的玉米根系放入13％(m/v)的甘露醇溶液中，室温黑暗处理1h。本步骤将这些根切成1cm长的圆柱体可以增大与酶解液的接触面积，促进根组织酶解；本步骤采用黑暗下高渗处理可以促进质壁分离，同时防止细胞在酶解过程中吸水破裂。

14、进一步地，所述步骤(4)包括以下步骤：

15、收集原生质体：将酶解完成的玉米根系取出放置于冰上，防止细胞死亡；加入与酶解液等体积的w5溶液终止反应，4℃ 1000rpm离心3min，收集原生质体；再加入5ml w5溶液轻轻重悬原生质体，4℃ 1000rpm离心3min；再加入5ml w5溶液重悬原生质体细胞，4℃1000rpm离心3min；加入w5溶液调整细胞浓度至5×105cells/ml，以备后续外源基因的瞬时转化。

16、进一步地，所述w5溶液包括以下终浓度的组分：2mm mes、154mm nacl、125mmcacl2、5mm kcl。

17、进一步地，所述步骤(5)包括以下步骤：

18、①用1ml丙酮溶解2mg fda配制成染料母液，贮存于-20℃；

19、②取0.1ml染料母液加入现配制的10ml 0.5mol/l甘露醇溶液，配制成fda染液，fda染液最终浓度为0.02％(m/v)；

20、③在室温下，将fda染液与原生质体悬浮液按照1∶1的体积比例混合；放于室温黑暗处染色10min；

21、④利用荧光显微镜观察显色情况，有活力的根系原生质体细胞发出黄绿色荧光，而无活力的原生质体细胞不发荧光；统计发光的细胞所占比例，计算活细胞的占比率。

22、第二个方面，本发明提供一种玉米根系原生质体转化方法，包括以下步骤：

23、(1)配制转化buffer，所述转化buffer中peg的浓度为30-50％(m/v)；

24、(2)将质粒、转化buffer与原生质体混匀后，在25℃，黑暗条件下转化15-25min，加入w5溶液轻柔混匀终止反应，并清洗。

25、(3)向清洗后的原生质体加入w5溶液，水平放置在25℃，黑暗的环境下孵育。

26、进一步地，所述步骤(1)转化buffer的配制包括以下步骤：

27、称取2.5g peg 4000，加入甘露醇和cacl2，使终浓度分别为0.2m与0.1m；加入ddh2o补足至5ml，放置于室温下至完全溶解。

28、进一步地，所述步骤(2)避光反应包括以下步骤：

29、按照100μl原生质体配比10-30μg质粒的比例配制转化体系，加入与质粒和原生质体的总体积相同体积的转化buffer轻柔混匀，水平放置在25℃黑暗条件下诱导转化15min；加入1ml w5溶液，轻柔混匀终止反应；常温1000rpm离心1min后去上清；再加1ml w5溶液清洗一次，常温1000rpm离心1min去上清。

30、进一步地，所述步骤(3)是向清洗后的原生质体加入500μl的w5溶液，轻柔混匀后水平放置。

31、本发明所具有的优点和有益效果是：

32、本发明通过系统地筛选出一套专门用于制备与转化玉米根系原生质体的方法，为研究根系中的功能基因提供了一种便捷高效的技术。本发明探索到最佳的玉米根系原生质体制备及转化方法，在该条件下，玉米根系原生质体的产量高、细胞活性好、转化效率高，整个过程耗时短，且能够获得较为可靠的实验结果。采用本发明方法进行玉米根系原生质体的制备，能够在较短时间内获得大量且活性较好的玉米根系原生质体细胞。采用本发明方法进行玉米根系原生质体的转化，可以快速完成外源基因的转化，进行相关的实验研究。在该方法下玉米根系原生质体的瞬时转化效率最佳。