用于成像基因DNA的荧光探针、成像系统及应用

本发明涉及生物成像，涉及一种示踪dna的荧光探针及成像系统，具体涉及一种用于成像基因dna的荧光探针、成像系统及应用，该系统的示踪具有高信噪比、高分辨率的效果。

背景技术：

1、人类基因组dna和染色体的功能与其细胞核内定位相关，dna示踪技术可以用来揭示相关的时空信息。常用的dna示踪技术是以荧光蛋白为成像工具的技术，目前已被广泛用于观察细胞内的染色体。这些工具在使用时需要在基因中插入外源序列，操作复杂而且会在一定程度上干扰染色体的功能和动力学。

2、常用的基因编辑工具crispr/cas9系统具有精准靶向染色体的特点，利用这一特点可以发展基于crispr的细胞内成像工具。通过改造cas9核酸酶得到催化失活的cas9蛋白(dcas9)，此时的crispr/dcas9系统保留了对特定基因位点的靶向性但不再具有切割活性，通过将荧光蛋白融合到dcas9蛋白上便可对靶标位点进行成像。第二种方式是将荧光蛋白融合到可被rna特异性结合的蛋白上，同时将能够特异性结合蛋白的rna融合到向导rna(small guide rna,sgrna)上，实现对靶标位点的成像。然而，这些荧光蛋白是稳定发荧光的，未结合到靶标的荧光蛋白会点亮整个细胞，导致高背景荧光，大大降低了成像分辨率，并且这些稳定发光的荧光蛋白经常会在核仁中聚集产生非特异性的核仁信号；因此这些现有的成像工具信噪比低，灵敏度低，只能做到对一些重复序列的示踪，无法做到示踪单拷贝序列，不利于对细胞内染色体的精准追踪。

3、综合以上，急需开发能对细胞内染色体进行高信噪比和高灵敏度追踪的荧光探针用于解决dna示踪问题。

技术实现思路

1、为了解决以上问题，本发明的目的在于提供一种用于成像基因dna的荧光探针，该荧光探针只在成功靶向目标后才会使荧光蛋白产生荧光信号，从而减少非靶标位置的背景荧光。

2、本发明的另一目的在于提供一种与上述用于成像基因dna的荧光探针特异性结合的融合蛋白。

3、本发明的第三个目的在于提供一种成像系统。

4、本发明的第四个目的在于提供上述成像系统的应用。

5、为了实现上述目的，本发明提供一种用于成像基因dna的荧光探针，由锚定区序列、向导rna的结构支架序列、pepper rna适体序列、连接序列a和连接序列b组成的一段rna；

6、其中，该靶向互补目标dna位点的锚定区序列位于向导rna的结构支架序列的5’端；

7、该向导rna的结构支架序列从5’端起第12个碱基后为第一插入位点，第48个碱基后为第二插入位点，在该第一插入位点和/或第二插入位点插入一个或多个pepper rna适体序列；

8、该向导rna的结构支架序列沿5’→3’如seq id no.1所示；

9、该pepper rna适体序列沿5’→3’如seq id no.2或seq id no.3所示；

10、该连接序列a位于该pepper rna适体序列的5’端与该向导rna的结构支架序之间，及位于多个该pepper rna适体序列之间；

11、其中，当插入的pepper rna适体序列为一个时，该位于pepper rna适体序列的5’端与该向导rna的结构支架序之间的连接序列a为如seq id no.4所示序列；

12、当插入的pepper rna适体序列为多个时，该位于pepper rna适体序列的5’端与该向导rna的结构支架序之间的及多个pepper rna适体序列之间的连接序列a选自如seq idno.5至seq id no.12所示的序列；

13、该连接序列b位于该pepper rna适体序列的3’端与该向导rna的结构支架序之间；

14、当插入的pepper rna适体序列为一个时，该位于pepper rna适体序列的3’端与该向导rna的结构支架序之间的连接序列b为seq id no.4所示序列的反向互补序列；

15、当插入的pepper rna适体序列为多个时，该位于pepper rna适体序列的3’端与该向导rna的结构支架序之间的连接序列b由如下序列中的两个或三个连接而成：a)最后两个pepper rna适体序列之间的连接序列a对应的反向互补序列a；和b)其余pepper rna适体序列之间的连接序列a去掉末尾最后一个核苷酸后的反向互补序列b；以及c)该pepper rna适体序列的5’端与该向导rna的结构支架序之间的连接序列a去掉末尾最后一个核苷酸后的反向互补序列c；

16、其中，当插入的pepper rna适体序列为2个时，上述a)中的反向互补序列a和c)中的反向互补序列c顺序排列并用3个腺嘌呤核糖核苷酸连接成为连接序列b；

17、当插入的pepper rna适体序列为3个或以上时，上述a)中的反向互补序列a、b)中的反向互补序列b和c)中的反向互补序列c顺序排列并用3个腺嘌呤核糖核苷酸连接成为连接序列b，且若为多个反向互补序列b时，反向互补序列b之间逆向排列并用3个腺嘌呤核糖核苷酸连接；

18、当该第一插入位点或第二插入位点不插入pepper rna适体序列时插入序列gaaa。

19、更进一步地，所述锚定区序列为与靶标序列互补的序列，该靶标序列为目标dna上一段12～20个核苷酸的序列，位于pam序列的上游，所述pam序列为ngg，其中，n为任意碱基，g为鸟嘌呤。

20、优选地，所述锚定区序列为seq id no.13至seq id no.19所示的序列中的任意一条。

21、本发明还提供一种特异性结合如上述荧光探针的融合蛋白，由荧光蛋白序列-连接肽段序列-入核序列-tdeg序列融合构成。

22、优选地，所述荧光蛋白序列为红色荧光蛋白编码序列、蓝色荧光蛋白编码序列、绿色荧光蛋白编码序列、黄色荧光蛋白编码序列或近红外荧光蛋白编码序列。

23、本发明还提供一种成像系统，包括表达上述的用于成像基因dna的荧光探针的载体、表达上述的融合蛋白的载体和表达dcas9蛋白的载体。

24、本发明还提供上述的成像系统在制备示踪细胞的药物中的应用。

25、优选地，所述示踪细胞中的示踪位置为染色体端粒、染色体着丝粒、染色体重复序列或染色体中低重复序列。

26、本发明还提供上述的成像系统在制备示踪细胞内异常染色体活动的药物中的应用。

27、本发明还提供上述的成像系统在制备示踪细胞内dna双链的断裂和修复的药物中的应用。

28、本发明提供的成像系统通过制备表达用于成像基因dna的荧光探针的载体、表达融合蛋白的载体和表达dcas9蛋白的载体后共转染到细胞中即可在荧光显微镜下观察到表达产物实现的荧光成像。

29、本发明提供的用于成像基因dna的荧光探针，其中的pepper rna适体序列与融合蛋白中的tdeg氨基酸序列特异性结合，可以促使融合蛋白中的荧光蛋白发光。tdeg序列具有两个关键结构域：降解结构域和结合结构域；其中降解结构域可以招募蛋白酶体将tdeg所连荧光蛋白降解，结合结构域用于实现与pepper rna适体的特异性结合。当pepper rna适体与tdeg结合后，pepper rna适体会遮盖tdeg的降解结构域，稳定tdeg所连接的荧光蛋白，从而可以观察到荧光信号。

30、本发明的有益效果在于：

31、本发明提供一种用于成像基因dna的荧光探针及成像系统，通过成像系统表达出的该荧光探针、相应的融合蛋白、dcas9蛋白，能够在不同细胞内对不同基因位点进行不同颜色的荧光示踪，具有很高的普适性，应用广泛，且能够实现染色体上单拷贝成像，灵敏度高，能够进行生物正交成像；信噪比高，本发明能够降低细胞内非靶标位点的背景荧光，在成像中具有明显的优势。本发明提供的用于成像基因dna的成像系统对于研究疾病染色体的生物学机制和病理进展具有重要意义，并为疾病的治疗和诊断提供关键信息。