一种DNA甲基化质控品及其制备方法与应用与流程

本发明属于dna甲基化质控品，具体涉及到一种dna甲基化质控品及其制备方法与应用。

背景技术：

1、dna甲基化(methylation)是真核细胞正常而普遍的修饰方式，也是哺乳动物基因表达调控的主要表观遗传学形式。近年来，越来越多的研究证据发现，dna的甲基化修饰与癌症的发生发展有着密不可分的关系。随着分子诊断技术的发展，一系列用来检测dna甲基化的技术如pcr，核酸质谱，焦磷酸测序和全基因组甲基化测序等在癌症早诊早筛中的作用也愈发重要。随着科技的进步和人们对癌症早筛意识的加强，关于癌症的dna甲基化检测试剂盒也相继问世。

2、由于各家试剂盒所检测的癌种和基因区域不一致，市面上很难有统一的质控品来对所有的试剂盒进行质量控制。

3、已经注册的dna甲基化检测试剂盒在进行性能评价时，一般采用的为临床样本或者细胞系来源的dna样本，由于临床样本具有不可重复性，细胞系来源的dna在筛选时具有较高的难度(不是所有区域都能筛选到相应的细胞系)，加上市面上缺乏目标区域明确甲基化水平的商业化质控品，这给甲基化检测试剂盒开发者和企业造成了极大的困扰。

技术实现思路

1、本发明提供了一种dna甲基化质控品及其制备方法与应用，以解决现有技术中存在的dna甲基化检测试剂盒在性能评价和日常质控中缺乏统一、稳定、可重复生产的质控品的技术问题。

2、第一方面，本发明提供了一种dna甲基化质控品的制备方法，包括以下步骤：

3、s1、确定目标区域，并对目标区域dna进行去甲基化基因编辑，筛选出特定细胞株；

4、s2、对特定细胞株进行培养和核酸纯化，获得目标区域去(或无)甲基化的gdna，为原料a；

5、s3、进行体外甲基化转移酶催化反应，获得目标区域完全(或高)甲基化的gdna，为原料b；

6、s4、针对目标区域设计甲基化特异性微滴式数字pcr引物和探针；

7、s5、对原料a和原料b进行数字pcr标定，确定原始gdna样本的甲基化水平；

8、s6、根据原始gdna样本的甲基化水平，将原料a和原料b按照不同比例进行混合，使其理论甲基化水平满足设定的甲基化梯度；

9、s7、对混合后的样本进行数字pcr的定量，标定其甲基化水平。

10、进一步地，步骤s1中，所述目标区域的cg位点占比在50～70％，所述目标区域可进行数字pcr探针和引物体系开发。优选的，目标区域是指与特定癌种或疾病相关的dna序列，一般包含多个cpg位点，目标区域可以是1个，也可以是多个，且该区域可进行数字pcr探针和引物体系开发。

11、进一步地，步骤s1中，对目标区域dna进行去甲基化基因编辑，筛选出特定细胞株的过程为：

12、采用改良crispr基因编辑技术，针对目标区域设计sgrna，以hct116dko细胞株为基础细胞株，对目标区域进行dna去甲基化的基因编辑并筛选出目标区域无甲基化或低甲基化的细胞株。

13、上述方案中，所述crispr基因编辑系统为dcas9-tet1，具体指将无催化功能的cas9蛋白(dcas9)和具有酶活性的tet1蛋白进行融合，该系统能够借助sgrna和dcas9蛋白，将tet1蛋白靶向牵引至目标基因组上的特定dna区域并进行去甲基化催化作用。所述hct116 dko细胞株为dnmt1和dnmt3b双敲除纯合子，基因组上整体甲基化水平较低。

14、上述方案的步骤s1中，筛选出特定细胞株包括：基因编辑后会得到大量的单克隆细胞，可通过数字pcr方法对基因编辑来源的单克隆细胞株进行甲基化水平的筛选，挑选目标区域无甲基化或者低甲基化的单克隆细胞株进行扩大培养。

15、进一步地，步骤s2中，特定细胞株培养时，在完全培养基中加入5-20μm的5-氮杂-2′-脱氧胞苷，优选终浓度为10μm的5-氮杂-2′-脱氧胞苷来对细胞内其他的dna甲基化转移酶进行抑制，使细胞在增长过程中基因组dna维持在一个低甲基化的状态。

16、进一步地，步骤s2中，核酸纯化的方法为：采用磁珠法来对核酸进行纯化，且纯化后的核酸a260/a280比值应在1.8～1.9之间。

17、进一步地，步骤s3中，所述体外甲基化转移酶催化反应中，所述酶与dna的配比为25units/μg dna，反应的温度为35～40℃，反应的时间为3～5h。

18、上述方案中，甲基化转移酶主要指商业化的甲基化酶，如neb公司的m.sssi或m.cvipi。当选择使用m.sssi酶时，所述酶与dna的最佳配比为25units/μgdna，最佳反应条件为37℃，4h；酶处理后还包括采用柱纯化法对处理后的dna进行回收的步骤。

19、进一步地，步骤s4包括针对完全(或高)甲基化的dna序列和完全去(或无)甲基化的dna序列分别设计开发特异性引物和探针，且探针的位置应覆盖cpg位点。

20、更进一步地，探针5′端标记的荧光基团为fam或hex，探针3′端标记的荧光淬灭基团为bhq1或mgb。

21、进一步地，步骤s4还包括对探针和引物进行阳性特异性，阴性特异性和交叉特异性验证，确保探针和引物特异性的结合相应的完全甲基化dna模板和完全去甲基化dna模板。

22、具体的，完全甲基化的dna序列和完全非(去)甲基化的dna序列是针对原始dna序列而言，假定其上的cpg位点全部为甲基化和全部为非甲基化的两种状态下，经过重亚硫酸盐处理后，理论上的dna碱基序列。

23、进一步地，步骤s5中，标定采用的是伯乐的qx200 droplet digital pcr和one-step ddpcr advanced kit for probes试剂组合。

24、进一步地，步骤s6中，所述甲基化梯度为0％-100％之间任意值和任意梯度组合方式。

25、上述方案中，一般情况下会设置阴性，弱阳，中阳和强阳等梯度，即0％，0.1％，1％，5％，10％等，也可根据实际的应用需求进行设置。将混合后的样本一一进行甲基化特异性微滴式数字pcr标定，标定值即为甲基化水平的参考值，标定后的样本为所述甲基化质控品。

26、第二方面，本发明提供了一种第一方面任一所述的dna甲基化质控品的制备方法制备得到的一种dna甲基化质控品。

27、第三方面，本发明提供了一种第二方面所述的dna甲基化质控品在dna甲基化检测试剂盒(非诊断目的)检测中的应用或在dna甲基化检测试剂盒性能评价中的应用。

28、上述dna甲基化质控品还适用于dna甲基化检测试剂盒性能评价中的应用，尤其是在评价试剂盒检测限，特异性，灵敏度，准确性和稳定性中的一种或多种性能中的应用。本发明首次提出甲基化特异性微滴式数字pcr定值质控品，甲基化水平明确，可重复生产，可以适用于市面上几乎所有核酸类试剂盒的性能评价。

29、上述dna甲基化质控品还可以模拟临床上的真实样本，可通过将dna甲基化质控品进行酶切或超声打断后，添加至人工血浆基质中，用来模拟真实临床血浆样本中cfdna的甲基化模式。

30、上述dna甲基化质控品，可根据试剂盒所申报的具体基因区域进行制备，可以满足市面上绝大部分试剂盒厂商以及检测机构的需求。

31、本技术实施例提供的上述技术方案与现有技术相比至少具有如下优点：

32、1、本发明中的dna甲基化质控品采用基因编辑技术获得低(或无)甲基化细胞株样本，同时在体外进行酶促反应获得高甲基化样本，可以对绝大多数基因区域的dna甲基化状态进行改造，可适用于市面上几乎所有癌种的试剂盒内靶标。

33、2、本发明中的dna甲基化质控品采用甲基化特异性微滴式数字pcr对dna样本的甲基化水平进行绝对定量，可保证定量结果的准确性，满足各家试剂盒厂商和检测机构对dna甲基化检测技术的性能评价。

34、3、本发明中的dna甲基化质控品还可以将不同癌种的不同基因靶标组合到一起，可同时满足多种癌种的dna甲基化检测需求。

35、4、本发明中的dna甲基化质控品能很好地解决市面上缺乏目标区域明确甲基化水平的商业化质控品，为dna甲基化检测技术评估提供一种可靠的参考物质。