AAV转染助转剂及其应用的制作方法

本发明涉及细胞病毒转染，尤其涉及一种电穿孔后细胞转染的aav转染助转剂及其应用。

背景技术：

1、随着免疫治疗产业的发展，细胞基因免疫疗法已经成为肿瘤治疗中最有前途的治疗策略之一。尤其是过继性t细胞疗法(adoptive transfer of t cells,at)已经在血液肿瘤等治疗方面取得了很好的疗效。过继性t细胞疗法是指从病人体内分离提取t细胞，在体外对其进行基因编辑，赋予其特异性识别肿瘤细胞的能力，并扩增至一定数量，再回输入病人体内，识别和杀伤肿瘤细胞。包括两种形式，一种是直接从患者肿瘤组织分离肿瘤浸润的淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,til)，经体外培养增殖后再输入患者体内；另外一种是从患者体内分选出t细胞，利用基因编辑技术，使其具备识别癌细胞表面特定抗原的能力，然后培养扩增至一定规模，再输入患者体内，包括嵌合抗原受体t细胞疗法和t细胞受体疗法(tcr-t)。

2、现阶段，基因编辑核酸酶的出现为基因组编辑提供了强大的工具，同时也为过继性t细胞治疗面临的问题提供了新的解决思路。尤其是crispr/cas9基因编辑系统，由于其易用性、简便性和可实现多基因编辑等优势，已成为基础生物医学研究和治疗应用中最强大的平台之一。

3、但是，crispr/cas9基因编辑系统中的电转穿孔法和外界物质对t细胞的影响，使电转后的细胞活率低、生物状态差，继而影响后续细胞扩增；同时，腺相关病毒(aav)作为载体，在携带外界目的基因进入t细胞时存在受阻，使得t细胞核中的某段基因的敲入效率低，导致t细胞中基因编辑成功率低，进而影响过继性t细胞疗法效果。增加了制备成本的同时加大了研发难度。

技术实现思路

1、基于上述问题，本发明提供了一种有利于提高免疫细胞电转穿孔后的活率、基因敲入率且转染效率的aav转染助转剂及aav转染助转染方法。

2、本发明的技术方案一如下：

3、一种aav转染助转剂，包括完全培养基及添加在所述完全培养基中含终浓度1μm～30μm的emricasan和终浓度1μm～30μm的m3814。

4、较好地，一实施例，在所述完全培养基中，emricasan的终浓度为10μm、m3814的含终浓度为4μm。

5、较好地，所述aav转染助转剂中，所述完全培养基包含x-vivo培养基且该x-vivo培养基中含终浓度5％的人ab血清及终浓度1.5％的il-2。

6、本发明还提供使用上述aav转染助转剂进行免疫细胞转染助转染，包括如下步骤：

7、从外周血(pbmc)中分选出免疫细胞；

8、第0天，取无血清培养基重悬免疫细胞，同时磁珠激活免疫细胞，获得激活免疫细胞悬液；并按照moi＝7，往所述激活免疫细胞转染悬液中加入慢病毒，进行慢病毒转染；

9、第1天，慢病毒转染完成后，加入上述完全培养基，对慢病毒转染的免疫细胞进行培养；

10、第3天，首先,去掉磁珠，离心慢病毒转染的免疫细胞且离心结束后去上清，加入2％fbs与dpbs的混溶液重悬离心后得到的沉淀液，得到重悬液；接着，重悬液离心、去上清，获得细胞沉淀；随后，往离心管中的细胞沉淀加入电转缓冲液并重悬，获得细胞悬液，并将细胞悬液转移至16孔电转孔板，其次，每孔加入电转体系液，并对细胞悬液中的免疫细胞进行电转穿孔，获得穿孔免疫细胞；再其次，往穿孔免疫细胞中加入预热的dpbs，置于培养氛围为37℃、5％co2的培养箱中静置孵育1h；最后，静置孵育结束后，将孵育后的穿孔免疫细胞转移至24孔板，并依次加入上述aav转染助转剂及aav病毒，获得aav病毒转染的基因编辑细胞；

11、第4天，将aav病毒转染的基因编辑细胞离心、去上清，离心沉淀细胞转移至24孔板，每孔加入完全培养基并对aav病毒转染的免疫细胞进行培养，直至第13天结束。

12、较好地，所述aav转染助转染方法中，第0天，所述无血清培养基为x-vivo培养基，该无血清培养基的加入量按照每2.0×106个细胞加入0.7ml；所选磁珠为cd3/cd28beads型磁珠；第1天，按照每2.0×106个细胞，补加1.4ml完全培养基。

13、较好地，所述aav转染助转染方法中，第3天，往细胞沉淀中加入电转缓冲液重悬时，按2.0×106细胞/孔的细胞密度往细胞沉淀中加入20μl/孔的电转缓冲液，且所述电转缓冲液包含体积比为1:4.5的nuclefector supplement(核素补充液)与nuclefectorsolution(核素溶液)。

14、较好地，所述aav转染助转染方法中，第3天，将细胞悬液转移至16孔电转孔板时，每孔加入3.4μl的电转体系液。

15、较好地，所述电转体系液的配制工艺如下：

16、根据电转孔板的使用孔数，按2.0×106细胞/孔的细胞密度配制含终浓度为0.8μlpga、终浓度为1.0μl grna与终浓度为1.6μl cas9的电转体系液；随后对电转体系液孵育15mi n，备用。

17、较好地，所述aav转染助转染方法中，第3天，往免疫细胞转染悬液中加入预热的dpbs时，dpbs的预热温度为37℃、预热时间为1h，且dpbs的加入量为80μl/孔。

18、较好地，所述aav转染助转染方法中，第3天，穿孔免疫细胞静置孵育结束后，还包括如下处理：

19、首先，将孵育后的穿孔免疫细胞分别转移至24孔板中；其次，每孔加入1m l上述aav转染助转剂；接着，按照moi＝100000,每孔加入20μl aav病毒；混合均匀后转染处理24h，获得aav病毒转染的基因编辑细胞。

20、较好地，所述aav转染助转染方法中，第4天，aav病毒转染的基因编辑细胞培养中，按2.0×106细胞/孔加入1ml完全培养基；第5天至第13天，按0.5×106细胞/ml的细胞密度，每隔两天补充完全培养基。

21、与现有技术相比，本发明具有如下优点：

22、1)、助转剂以小分子化合物为主，添加的小分子化合物未带入其它残留成分，对免疫细胞没有毒性作用，减少了aav对细胞的毒副作用，使得aav转染后的免疫细胞具有更高的临床安全性；同时，还能提升电穿孔后免疫细胞的活力；

23、2)、助转剂的组分emr icasan可有效抑制细胞表面凋亡标记物caspase-3蛋白活性，促进细胞自我修复作用，使得电穿孔后免疫细胞的活力增加；同时，还提升电穿孔后免疫细胞的扩增倍数；

24、3)、助转剂的组分m3814可使外源供体dna容易靶向目标基因敲入的免疫细胞，即aav容易进入免疫细胞中，从而有效提高目标基因的敲入效率，提升了基因编辑细胞的杀瘤能力；

25、4)、转染助转剂以emricasan和m3814为主要成分，市场来源广，价格便宜，大大降低了aav转染成本；

26、5)、在aav转染助转染工艺中，第0天往免疫细胞中加入慢病毒培养，其作用是将基因编辑片段转入免疫细胞后，可以提升免疫细胞的杀瘤率。