用于微量或降解基因组DNA的甲基化文库制备方法及其试剂盒与流程

本技术涉及甲基化测序，特别是微量或降解基因组dna的甲基化文库制备。本技术还涉及用于微量或降解基因组dna的甲基化文库的试剂盒。本技术的方法和试剂盒特别适用于对甲基化目标区域进行测序分析，且该方法和试剂盒适合微量或降解性严重的样本的文库构建。

背景技术：

1、第二代高通量测序也称为下一代测序技术，可以实现一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定。现阶段，二代测序在科研上主要应用于基因组测序、转录组测序、群体测序、扩增子测序、宏基因组测序、重测序等。而临床方面，在辅助生殖，如非侵入性产前检查(non-invasive prenatal test，nipt)；遗传性疾病，如遗传性致病突变筛查；肿瘤研究，如早期诊断，用药指导，预后判断等中发挥着越来越重要的作用。

2、dna甲基化是基因组dna的一种主要表观遗传修饰形式。近年来的大量研究表明，dna异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。甲基化测序的一个金标准是全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing，wgbs)，简称bs-seq。其检测原理是用重亚硫酸盐处理，将基因组中未发生甲基化的c碱基转换成u，进行pcr扩增后变成t，与原本具有甲基化修饰的c碱基区分开来，再结合高通量测序技术，与参考序列比对，即可判断cpg/chg/chh位点是否发生甲基化。要实现这一过程，首先需要对基因组进行文库构建，加上适合的接头，然后在测序平台上进行测序。而根据重亚硫酸盐在文库构建过程中加入的不同顺序，可以文库构建分成转化前建库(pre-bs)和转化后建库(post-bs)。pre-bs建库方式需要比较高的投入量，且构建的文库多为at偏好，容易丧失cpg含量较为密集的区域，丢失重要表观遗传信息。而post-bs建库方式，因对dna先进行重亚硫酸盐处理，接着使用连接或pcr的方式进行建库，样本起始量要求低，能够满足多种样本类型如cfdna(cell free dna)、ffpe dna等特殊样本的测序需求。

3、而市场上有诸多测序平台，illumina平台凭借其超低的测序成本和可以接受的读长，成为了目前最主流的二代测序公司。本发明开发了一种低样本起始量下进行wgbs文库构建的方法。其产物可以用于杂交捕获，数据利用率很高。

技术实现思路

1、本技术的目的在于提供一种用于微量或降解基因组dna的甲基化文库制备方法及其试剂盒。在文库构建过程中，对用到的接头进行了改进，流程上进行了优化，使得其可用于全基因组重亚硫酸盐测序(wgbs)和用于杂交快速建库。本技术的dna文库制备方法，同时也可以用于甲基化目标区域测序。在杂交捕获流程中进行验证，取得很好的效果，且测序指标优于市面上转化后建库试剂盒的效果(去重后有效测序深度等重要指标，见附图)。同时该方法也能适合微量或降解性严重的样本的文库构建，最低起始量低至1ng。

2、本技术的具体技术方案如下：

3、1.构建全基因组甲基化文库的方法，包括以下步骤：

4、(1)从生物样本中提取并分离目的基因组dna；

5、(2)对提取后的基因组dna进行重亚硫酸盐转化；

6、(3)在基因组dna片段的5'端加上一个磷酸；

7、(4)用连接酶将接头1连接至基因组dna片段的一端，对连接有接头1的所述基因组dna片段进行捕获和纯化；

8、(5)再次用连接酶将接头2连接到基因组dna片段的另一端，对连接有接头1和2的所述基因组dna片段进行捕获和纯化；

9、(6)通过pcr扩增文库并纯化产物得到全基因组甲基化文库；

10、其中所述接头1和接头2的长度分别为30-50个核苷酸，优选所述接头1和接头2的长度分别为32-45个核苷酸，更优选所述接头1和接头2的长度分别为33-42个核苷酸；

11、所述生物样本可以是新鲜组织、ffpe样本即福尔马林固定石蜡包埋样本或血浆。

12、2.根据项1所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中所述步骤(4)和步骤(5)中的捕获和纯化步骤是用磁珠或纯化柱完成的；所述纯化柱优选为zymo的货号为c1003-50的纯化柱。

13、3.根据项1或2所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中，当所述生物样本为新鲜组织或ffpe样本即福尔马林固定石蜡包埋样本时，在步骤(1)中还有对基因组dna进行片段化的步骤；进行片段化的方法选自雾化、超声片段化、或hydroshear处理。

14、4.根据项3所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中在所述片段化步骤中，将所述基因组dna打断至300-400bp的片段；步骤(6)中的所述纯化步骤用磁珠纯化。

15、5.根据项1-4中任一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中，所述步骤(4)中的所述接头1含有seq id no:1和seq id no:2所示的核苷酸序列、或由如seq id no:1和seq id no:2所示的核苷酸序列组成；所述步骤(5)中的所述接头2含有seq id no:3和seqid no:4所示的核苷酸序列、或由如seq id no:3和seq id no:4所示的核苷酸序列组成。

16、6.根据项5所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中：

17、seq id no:1所示序列的5’端被磷酸化；seq id no:2的5’端不被磷酸化，3’端被封闭基团封闭；所述封闭基团优选为碳间隔、双脱氧核苷酸等；

18、seq id no:3所示序列的5’端被磷酸化；seq id no:4的5’端不被磷酸化，3’端不被封闭基团封闭。

19、7.根据项1-6任一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中在步骤(3)中含有dna变性步骤。

20、8.根据项1-7中任一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其用于纳克级别的基因组dna，优选1ng-20ng，更优选1ng-10ng，更优选1ng-5ng，更优选1ng-3ng，最优选1ng。

21、9.根据项1-4中任一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中步骤(4)和(5)中磁珠的用量为0.8-2倍，优选为1-1.2倍。

22、10.根据项1-4中任一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中步骤(4)和(5)中所用的连接酶选自以下一种或多种：nad-依赖性连接酶，比如taq dna连接酶、丝状栖热菌(thermus filiformis)dna连接酶、大肠杆菌(e.coli)dna连接酶、tth dna连接酶、水管致黑栖热菌(thermus scotoductus)dna连接酶(i和ii)、热稳定连接酶、ampligase热稳定dna连接酶、vanc-型连接酶和9°n dna连接酶；和atp-依赖性连接酶，其包括t4rna连接酶在内、t4 dna连接酶、t3 dna连接酶、t7 dna连接酶、pfu dna连接酶、dna连接酶1、dna连接酶iii和dna连接酶iv。

23、11.根据项10所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中步骤(4)和(5)中所用的连接酶为t4 dna连接酶。

24、12.根据项1～4中任意一项所述构建全基因组甲基化文库的方法，其中，所述步骤(6)中，在通过pcr扩增文库并纯化产物后，还包括质量检测的步骤：检测扩增后的产物片段长度，当产物片段长度为150bp-400bp，则得到的产物为全基因组甲基化文库；优选产物片段长度为150-300bp。

25、13.一种全基因组甲基化文库建库试剂盒，其用于如项1～12任意一项所述的构建全基因组甲基化文库的方法；

26、包括目的基因组dna的提取和分离试剂、重亚硫酸盐转化试剂、核酸5’端磷酸化试剂、接头1和接头2寡核苷酸、接头序列连接试剂、磁珠、pcr扩增试剂。

27、14.一种基因组甲基化目标区域测序方法，其包括以下步骤：

28、(1)采用如项1～12任意一项所述的构建全基因组甲基化文库的方法进行建库；

29、(2)文库样本与探针杂交捕获；

30、(3)捕获后pcr扩增、纯化和质检。

31、15.用于构建dna文库的接头，其包含如seq id no:1-4任一项或多项所述的核苷酸序列，或由如seq id no:1-4任一项或多项所述的核苷酸序列组成。

32、16.根据项15所述的用于构建dna文库的接头，其中所述文库是全基因组甲基化文库。

33、17.根据项15所述的用于构建dna文库的接头，其中所述文库是微量文库；优选所述文库是微量dna全基因组甲基化文库。

34、技术效果

35、本技术提供了一种用于甲基化全基因组建库(wgbs)和甲基化目标区域建库的方法，可用于二代文库制备。此方法可以实现：1)快速且得率很高的wgbs建库和甲基化目标区域建库，并能应用于杂交捕获流程，杂交捕获相较于市面上常用试剂盒，可以达到更高的数据利用率；2)低起始量建库(可用于1ng建库)；3)成本低，操作流程简单；4)适用于所有的样本类型dna，如新鲜组织基因组、ffpe样本(formalin-fixed and parrffin embedded，即福尔马林固定石蜡包埋样本)基因组，血浆游离dna等；5)有很高的数据利用率，对于甲基化目标区域测序能带来更高的分子多样性。