一种利用高吸湿性抗氧化肽组分改善反复冻融肉糜品质的方法与流程

本发明涉及食品加工领域，更具体地说，涉及一种利用高吸湿性抗氧化肽组分改善反复冻融肉糜品质的方法。

背景技术：

1、冷冻贮藏是原料肉和肉制品保质的主要方式。然而由于冷链体系的不完善以及贮运等环节的温度波动，使得冷冻肉不可避免地出现反复冷冻-解冻(反复冻融)现象。冻融过程中冰晶的反复形成会引起冰晶体积增大，并在肌肉纤维中多次重新分布，导致肌肉细胞结构被破坏，反复冻融还会诱发脂质和蛋白质氧化，最终引起肉品汁液流失、功能品质下降和营养损失等问题。据统计我国每年由于冷冻肉制品汁液流失造成的行业经济损失已超450亿元。特别是当前需求量逐渐增大的肉丸、肉饼、肉肠等调理肉制品所需的肉糜原料，如何防止其在反复冻融过程中由于汁液流失和氧化导致的品质劣变已成为肉制品加工中亟待解决的关键问题。

2、利用不同蛋白质资源开发天然抗氧化肽是目前的研究热点之一。抗氧化肽能抑制肉糜制品在反复冻融过程中的氧化酸败，但对“冰晶形貌”变化导致的汁液流失以及品质劣变的影响尚不明确。防止产生“大体积”冰晶，探索形成“细小均匀”冰晶的有效方法，是降低反复冻融对肉糜制品危害的主要途径。开发具有强吸湿能力的抗氧化肽，能有效束缚水分子，降低“共晶点”温度，减少大冰晶体的形成量，改善反复冻融对肉及肉制品品质的负面影响。

3、虾蛄(oratosquilla oratoria)，又叫皮皮虾，广泛分布于我国沿海城市，其中以黄海、渤海产量最大。虾蛄壳废弃物中含有丰富的蛋白质等营养成分，但并没有得到高效利用，废弃虾壳堆积过久发生腐烂还会污染环境。利用虾蛄壳废弃物开发具有高吸湿性的抗氧化肽，不仅充分利用资源，提高虾类加工的附加值，还能有效地解决肉糜制品在反复冻融过程中发生的品质劣变。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术中存在的不足之处，提供一种利用高吸湿性抗氧化肽组分改善反复冻融肉糜品质的方法。

2、为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

3、一种利用高吸湿性抗氧化肽组分改善反复冻融肉糜品质的方法，包括下述步骤：

4、步骤(1)：从虾蛄壳中提取具有强吸湿能力的蛋白质：虾蛄壳经清洗、冷冻干燥机干燥，再用粉碎机粉碎处理后得到虾壳粉，虾壳粉与0.5mol/l的乙二胺四乙酸缓冲液按照质量：体积(w/v)为20～30：100混合，混合后调节ph值，添加2000～4000u/g的蛋白酶，在4℃下搅拌20～24小时分解虾壳粉得到蛋白质混合液，在蛋白质混合液中加入饱和度为40％～60％的硫酸铵，使用离心机在6000g转速下离心40分钟，沉淀上述蛋白质混合液得到蛋白质沉淀物。取蛋白质沉淀物溶解于ph 7.0、0.5mmol/l的磷酸盐缓冲液中，形成混合溶液，然后用截留分子量为2～4kda的透析袋对上述混合溶液进行透析去除硫酸铵，用冷冻干燥机干燥后即得具有强吸湿能力的虾壳粉蛋白。

5、步骤(2)：用去离子水配制50mg/ml的蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶，酶量为35u/g，酶解ph值为6～7，酶解温度为40～60℃，酶解1～3小时，结束后沸水浴灭酶10分钟，冷却至室温，得到蛋白酶解液。

6、步骤(3)：用截留分子量为1kda的分离装置对蛋白酶解液进行超滤，收集分子量<1kda的滤出液；用sephacryl s-200凝胶柱对分子量<1kda的滤出液进行分离，用去离子水洗脱，流速为0.5ml/min，采用紫外-可见分光光度计测定洗脱组分在214nm处的吸光度值，收集第1-15管(每管5ml)多肽组分；采用纳升液相色谱-高分辨质谱仪从上述多肽组分中鉴定出4条主要多肽，4条主要多肽的氨基酸序列分别为iiapperk、ppeakpgak、ehlgeagr和vfdgtirk，这4条主要多肽的总峰面积占上述多肽组分总峰面积的90％，4条主要多肽的平均分子量为904da。并对该多肽组分进行吸湿性的测定和抗氧化活性的测定，对4条主要多肽进行吸湿性的测定、抗氧化活性的测定、毒性和亲水性的检测，其中抗氧化活性的测定使用dpph法或者abts法，此多肽组分为高吸湿性抗氧化肽组分。

7、步骤(4)：测定高吸湿性抗氧化肽组分和4条主要多肽的吸湿性，在20℃、相对湿度65％条件下，在24h时高吸湿性抗氧化肽组分的吸湿率达到29.2％，在24h时4条主要多肽的吸湿率达到25.3％～32.8％。

8、步骤(5)：测定高吸湿性抗氧化肽组分和4条主要多肽的抗氧化活性，采用dpph法测定的高吸湿性抗氧化肽组分和4条主要多肽的dpph自由基清除活性分别为24.2mm te/μm多肽、20.9～26.5mm te/μm多肽；或者采用abts法，测定的高吸湿性抗氧化肽组分和4条主要多肽的abts自由基清除活性分别为8.92mmte/μm多肽、8.43～9.14mmte/μm多肽。

9、步骤(6)：将上述高吸湿性抗氧化肽组分和肉糜按照质量：质量(w/w)为2～10：100添加至肉糜中，置于-18℃条件下冷冻，5～7天后取出，解冻至中心温度为0℃后再次冻存，此为一个冻融处理。共冻融循环3～9次，解冻损失率减少4.8％～7.8％。并测定每次解冻后肉糜的挥发性盐基氮(tvb-n)值和脂质过氧化，评价肉糜的新鲜度。

10、步骤(7)：将上述高吸湿性抗氧化肽组分与肉糜按照质量：质量(w/w)为4：100添加至肉糜中，置于-18℃条件下冷冻，5天后取出，冻融循环3次，解冻损失率为3.89％，冻融循环6次，解冻损失率为4.45％，循环冻融循环9次，解冻损失率为6.75％。

11、步骤(8)：将上述未添加高吸湿性抗氧化肽组分的肉糜，置于-18℃条件下冷冻，5天后取出，循环冻融循环3次，解冻损失率为8.64％，循环冻融循环6次，解冻损失率为11.85％，循环冻融循环9次，解冻损失率为14.54％。

12、所述的步骤(7)与步骤(8)中，冻融循环3次，解冻损失率对比，减少4.8％；冻融循环6次，解冻损失率对比，减少7.4％；冻融循环9次，解冻损失率对比，减少7.8％。说明上述高吸湿性抗氧化肽组分可以降低反复冻融肉糜的解冻损失。

13、步骤(9)：将上述高吸湿性抗氧化肽组分和肉糜按照质量：质量(w/w)为4：100添加至肉糜中，置于-18℃条件下冷冻，5天后取出，进行挥发性盐基氮(tvb-n)值的测定和脂质过氧化(tbars值)测定，冻融循环3次，tvb-n值和tbars值分别为9.35mg/100g和0.09mg/kg，冻融循环6次，tvb-n值和tbars值分别为14.65mg/100g和0.12mg/kg，冻融循环9次，tvb-n值和tbars值分别为22.83mg/100g和0.14mg/kg。

14、步骤(10)：将上述未添加高吸湿性抗氧化肽组分的肉糜，置于-18℃条件下冷冻，5天后取出，进行挥发性盐基氮(tvb-n)值的测定和脂质过氧化(tbars值)测定，冻融循环3次，tvb-n值和tbars值分别为15.44mg/100g和0.13mg/kg；冻融循环6次，tvb-n值和tbars值分别为20.85mg/100g和0.16mg/kg；冻融循环9次，tvb-n值和tbars值分别为35.65mg/100g和0.20mg/kg。

15、步骤(11)：将步骤(9)与步骤(10)中测定的挥发性盐基氮(tvb-n)值和脂质过氧化值进行对比，冻融循环3次，tvb-n值和tbars值分别减少了6.09mg/100g和0.04mg/kg，冻融循环6次，tvb-n值和tbars值分别减少了6.2mg/100g和0.04mg/kg，冻融循环9次，tvb-n值和tbars值分别减少了12.82mg/100g和0.06mg/kg，说明上述高吸湿性抗氧化肽组分的抗氧化活性有效地抑制了因肉蛋白质腐败分解而造成的挥发性盐基氮的形成以及脂质氧化，保持了肉糜的新鲜度。

16、步骤(12)：将未添加高吸湿性抗氧化肽组分的肉糜与添加4％(w/w)上述高吸湿性抗氧化肽组分的肉糜进行反复冻融处理后，测定肉糜的凝胶强度并进行对比：未添加高吸湿性抗氧化肽组分的肉糜与添加4％(w/w)高吸湿性抗氧化肽组分的肉糜的初始凝胶强度分别为120.60g和128.41g，冻融循环3次，两组肉糜的凝胶强度分别为92.57g和122.50g，冻融循环6次，两组肉糜的凝胶强度分别为78.43g和106.63g，冻融循环9次，两组肉糜的凝胶强度分别为62.18g和88.67g。未添加高吸湿性抗氧化肽组分的肉糜凝胶强度随冻融次数的增加而下降，冻融9次后，凝胶强度仅为62.18g，与初始值(120.60g)相比下降了48.4％；添加4％(w/w)上述高吸湿性抗氧化肽组分削弱了冻融循环引起的肉糜蛋白质降解及蛋白质变性聚集，冻融9次后，添加4％(w/w)上述高吸湿性抗氧化肽组分的肉糜的凝胶强度与初始值(128.41g)相比，仅降低约30％，说明上述高吸湿性抗氧化肽组分能延缓反复冻融处理导致的肉糜凝胶品质劣变。

17、进一步，所述的步骤(1)中调节ph值，添加2000～4000u/g的蛋白酶，具体表述为调节ph值为7～8，添加2000～4000u/g的复合蛋白酶，复合蛋白酶为胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶按照1:1比重混合。

18、进一步，所述的步骤(1)中调节ph值，添加2000～4000u/g的蛋白酶，具体表述为调节ph值为2～3，添加2000～4000u/g的胃蛋白酶。

19、进一步，所述的步骤(2)中木瓜蛋白酶，为市场采购的木瓜蛋白酶或者具体为采购于中国上海阿拉丁试剂有限公司的木瓜蛋白酶。

20、进一步，所述的步骤(2)中酶解ph值为6.5，酶解温度为50℃，酶解时间为2小时。结束后沸水浴灭酶10分钟，冷却至室温。

21、进一步，所述的步骤(3)中截留分子量为1kda的分离装置为截留分子量为1kda的超滤膜。

22、进一步所述的步骤(3)中毒性和亲水性的检测，利用toxinpred数据库检测4条主要多肽的毒性和亲水性。高吸湿性抗氧化肽组分中氨基酸序列分别为iiapperk、ppeakpgak、ehlgeagr、vfdgtirk的4条主要多肽均无毒性，其亲水性分别为0.61、0.89、0.78、0.35。

23、进一步，所述的步骤(3)中sephacryl s-200凝胶柱为丙烯葡聚糖凝胶柱。

24、进一步，所述的步骤(3)中吸湿性的测定：准确称取一定量的样品于玻璃培养皿中，再置于相对湿度(rh)65％，温度20℃的恒温恒湿箱中。分别称量放置2、4、6、8、10、12、24小时后样品的质量。吸湿率按下列公式①计算：

25、

26、式中：m1和m0分别为放置后和放置前样品的质量。

27、进一步，所述的步骤(3)中抗氧化活性的测定：采用dpph法和abts法测定抗氧化活性。

28、其中dpph法：取0.2mmol/l的dpph乙醇溶液与样品等体积混合，避光反应30分钟，于517nm处测定吸光度值。对照组以无水乙醇替代样品，空白组以无水乙醇替代dpph溶液。dpph自由基清除率按下列公式②计算：

29、

30、式中：a1、a2和a3分别为样品组、空白组和对照组的吸光度值。

31、配制浓度依次为20、40、60、80、100μmol/l的水溶性维生素e(trolox)标准溶液，并测定其dpph自由基清除率。绘制标准曲线，最终样品的dpph自由基清除能力表示为mmtrolox equivalent(te)/μm多肽。

32、其中abts法：将7mmol/l的abts+溶液(10ml)与140mmol/l的过硫酸钾溶液(176μl)于室温避光反应16小时。使用前用无水乙醇将混合液稀释至吸光度值a734nm为0.70±0.05。取0.2ml的样品与3.8ml的abts自由基溶液混合，避光反应6分钟，于734nm处测定吸光度值。对照组以无水乙醇替代样品。abts自由基清除率按下列公式③计算：

33、

34、式中：a1和a2分别为对照组和样品组的吸光度值。

35、测定不同浓度trolox(20～100μmol/l)的abts自由基清除率，绘制标准曲线，样品的abts自由基清除能力表示为mm trolox equivalent(te)/μm多肽。

36、进一步，所述的步骤(6)中，肉糜可以是猪肉、鸡肉等畜禽肉糜、鱼糜或虾肉糜等。

37、进一步，所述的步骤(6)中解冻损失的测定：将肉糜制成100g的肉糜饼，解冻完成后，用滤纸将肉糜饼表面渗出的水分擦干净，准确称量肉糜饼的质量。解冻损失率按下列公式④计算：

38、

39、式中：m1和m2分别为解冻前和解冻后的质量。

40、进一步，所述的步骤(6)中挥发性盐基氮(tvb-n)值的测定：tvb-n值的检测方法按照gb/t 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》进行。

41、进一步，所述的步骤(6)中脂质过氧化测定：采用硫代巴比妥酸反应物(tbars)比色法。取20g捣碎肉糜，与25％的三氯乙酸溶液(50ml)和蒸馏水(40ml)混合，均质后离心，取2ml上清液，加入等体积的硫代巴比妥酸(tba)溶液，于沸水浴中反应20min，冷却后测定吸光度值。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷作标准曲线，tbars值按下列公式⑤计算：

42、

43、式中：a为吸光度值；v为肉糜体积，ml；m为丙二醛摩尔质量，72.063g/mol；ε为摩尔吸光系数；l为光程，1cm；m为肉糜质量，g。

44、进一步，所述的步骤(12)中凝胶强度测定：取适量肉糜放入50ml的烧杯中压实，密封后置于水浴锅中，以2℃/min的速率从20℃升温至80℃，并在80℃保持20min。形成凝胶后取出冷却，置于4℃冷藏库过夜。利用ta.xt plus质构仪测定凝胶强度，选用p50探头，测试全过程设定探头速率均为1mm/s，凝胶强度定义为破坏凝胶结构需要的初始力。

45、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

46、1、本发明的高吸湿性抗氧化肽组分主要由4条氨基酸序列分别为iiapperk、ppeakpgak、ehlgeagr、vfdgtirk的多肽组成，属于小分子肽，4条主要多肽的平均分子量为904da，平均亲水性为0.66。经检测，该高吸湿性抗氧化肽组分具有很强的吸湿性和抗氧化活性，在20℃、相对湿度65％条件下，24h后的吸湿率可以达到29.2％。

47、2、本发明的高吸湿性抗氧化肽组分与其所包含的4条主要多肽的吸湿性和抗氧化活性相当，因此，从简化工艺流程和节省成本的角度考虑，选择此高吸湿性抗氧化肽组分对反复冻融肉糜进行保护，降低肉糜的解冻损失率和脂质过氧化程度。

48、3、本发明的高吸湿性抗氧化肽组分，能够通过束缚水分子，减少大冰晶体量的形成，降低肉糜解冻损失率，同时发挥抗氧化作用，抑制反复冻融过程中的氧化链式反应，从而减缓蛋白质氧化变性，保护蛋白质的结构和凝胶性能，改善反复冻融导致的肉糜品质劣变。

49、4、本发明的高吸湿性抗氧化肽组分，来源于虾蛄壳，安全性高，无毒副作用。

50、5、本发明不同于传统方法直接以虾壳粉为原料进行酶解，而是选择具有强吸湿能力的虾蛄壳蛋白为原料，以吸湿性和抗氧化活性为指标进行酶解，通过控制酶解条件，得到高吸湿性抗氧化肽组分，操作简便，准确性高，实用性强。