一种同时检测幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因及CYP2C19基因多态性的靶向测序方法与流程

本发明涉及一种同时检测多个不同靶基因的二代测序方法，尤其涉及幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因以及宿主cyp2c19基因多态性的检测。

背景技术：

1、幽门螺杆菌(helicobacter pylori, hp)是一种寄生在胃部的革兰氏阴性螺旋形、微厌氧细菌，hp感染可导致胃炎、胃溃疡、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌等。目前，根除hp的治疗方案多采用铋剂四联（质子泵抑制剂（ppi）、铋剂和2种抗生素），所用的抗生素主要包括克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、四环素、甲硝唑、呋喃唑酮等。而近年来，随着全球的幽门螺杆菌菌株对常用抗生素的耐药性不断增加，显著影响了幽门螺杆菌标准疗法的根除效率。为了更好的治疗幽门螺杆菌，应针对患者的耐药情况采用有效的抗生素，有利于降低个人耐药率，及时根除幽门螺杆菌。

2、另一方面，幽门螺杆菌在一些感染者中并不会引发任何健康问题，但在部分患者中会引起机体炎症甚至胃癌。大量研究表明幽门螺杆菌菌株致病性的差异主要与其毒力基因型致癌蛋白细胞毒素a（caga）和空泡细胞毒素a（vaca）有关。caga位于cagpai，主要通过ⅳ型分泌系统进入宿主细胞，与消化性溃疡、萎缩性胃炎、胃癌的发生密切相关。vaca可诱导细胞胞浆发生空泡变性，从而导致胃黏膜上皮细胞损伤和溃疡。其中vaca又分为s1/m1型、s1/m2型、s2/m1型、s2/ m2型，毒性依次减弱。大量研究表明，vaca基因的s1/m1型与caga阳性显著相关，且二者同时存在的菌株与胃癌的发生显著相关。cyp2c19是细胞色素p450酶系超家族成员之一，是一种重要的药物代谢酶。cyp2c19具有遗传多态性，在人群中差异较大，这种多态性是因编码cyp2c19的基因发生突变而导致酶的活性改变，引起不同个体对相关药物的代谢速度或效率发生变化，从而影响药物的疗效乃至产生不同程度的药物不良反应。目前多针对cyp2c19*2（rs4244285，c.681g>a），cyp2c19*3（rs4986893，c.636g>a），cyp2c19*17（rs12248560,c.-806c>t））进行检测，可将服药人群分为4 类代谢患者：超快代谢者（um）、快代谢者（em）、中间代谢者（im）和慢代谢者（pm）4 种表型。

3、目前针对幽门螺杆菌耐药性的检测主要采用表型评估方法，如琼脂稀释法（金标准），但这些方法耗时昂贵且需要高标准的技术要求，还具有强烈的主观依赖性。从而发展出利用分子生物学方法检测幽门螺杆菌及其耐药性，目前常用的耐药性检测方法主要包括基于pcr的电泳法，荧光定量pcr法以及一代测序技术，这些方法相比于传统方法更快、更准、更敏感。但现有的分子检测方法，一个检测反应的检测通量有限，无法涵盖抗生素耐药性基因型的所有可能的复杂结构变体。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种同时检测到幽门螺杆菌耐药基因（克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、四环素、甲硝唑、呋喃唑酮）、毒力基因（caga、vaca）及宿主cyp2c19基因多态性（cyp2c19*2，cyp2c19*3，cyp2c19*17）的靶向测序方法。

2、本发明采用如下技术方案：

3、一种同时检测幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因及cyp2c19基因多态性的靶向测序方法，包括以下步骤：

4、（1）以待测样本总dna为模板，进行多重pcr扩增；

5、（2）在步骤（1）得到的多重pcr产物的3端加a和5端磷酸化；然后连接接头，进行pcr扩增；然后在pcr产物上添加索引序列，得到测序文库；

6、（3）对测序文库进行高通量测序，获得测序序列；将测序序列与数据库中的靶向序列进行数据比对，实现幽门螺杆菌不同靶基因的同时检测。

7、本发明公开了一种同时检测幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因及cyp2c19基因多态性的测序文库的制备方法，包括以下步骤：

8、（1）以待测样本总dna为模板，进行多重pcr扩增；

9、（2）在步骤（1）得到的多重pcr产物的3端加a和5端磷酸化；然后连接接头，进行pcr扩增；然后在pcr产物上添加索引序列，得到测序文库。

10、本发明公开了一种同时检测幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因及cyp2c19基因多态性用扩增产物的制备方法，包括以下步骤：

11、（1）以待测样本总dna为模板，进行多重pcr扩增，得到同时检测幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因及cyp2c19基因多态性的扩增产物。

12、本发明公开了同时检测幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因及cyp2c19基因多态性用引物组，包括引物对1至引物对22中的一种或几种；优选的，引物组对由引物对1至引物对22组成。

13、本发明公开了同时检测幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因及cyp2c19基因多态性用试剂盒，包括引物组，还包括常规pcr试剂，进一步包括3端加a试剂、5端磷酸化试剂、pcr连接接头试剂以及制备文库的试剂。所述引物组包括引物对1至引物对22中的一种或几种；优选的，引物组对由引物对1至引物对22组成。

14、本发明中，引物对1至引物对22的序列参见表1。

15、本发明公开了上述同时检测幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因及cyp2c19基因多态性的测序文库、同时检测幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因及cyp2c19基因多态性用扩增产物、同时检测幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因及cyp2c19基因多态性用引物组或者同时检测幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因及cyp2c19基因多态性用试剂盒在制备同时检测幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因及cyp2c19基因多态性的靶向测序体系中的应用；或者在同时检测幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因及cyp2c19基因多态性的靶向测序中的应用。本发明所述应用可以获取中间信息，非诊断目的。优选的，应用时，以待测样本总dna为模板，在引物组存在下进行多重pcr扩增，此为本发明的创造性之一，然后在多重pcr产物的3端加a和5端磷酸化；然后连接接头，进行pcr扩增；然后在pcr产物上添加索引序列，得到测序文库；对测序文库进行高通量测序，获得测序序列；将测序序列与数据库中的靶向序列进行数据比对，实现幽门螺杆菌不同靶基因的同时检测。

16、本发明公开了一种非诊断目的的检测幽门螺杆菌耐药位点、毒力基因及cyp2c19基因多态性的靶向测序方法，待测样本的来源可以为胃黏膜或粪便样本，该检测方法灵敏度高、准确度高，能够用于幽门螺杆菌含量少的样本，尤其在低浓度的幽门螺杆菌存在的情况下仍能准确、方便、快速、高通量的同时获取到幽门螺杆菌的耐药信息、毒力程度及宿主的药物代谢类型。

17、本发明中，幽门螺杆菌不同靶基因包括耐药基因、毒力基因及宿主cyp2c19基因；进一步，耐药位点包括对克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、四环素、甲硝唑、呋喃唑酮耐药基因的突变位点，毒力基因包括致癌蛋白细胞毒素a（caga）、空泡细胞毒素a（vaca），宿主cyp2c19基因包括cyp2c19*2、cyp2c19*3、cyp2c19*17。

18、本发明中，进行多重pcr扩增前，需要进行待测样本总dna的提取并进行样本总dna质控。在本发明的优选方案中质控结果od260/od280比值在1.6-2.1之间，核酸浓度>5ng/μl的dna样本为合格样本，可用于该检测。

19、本发明中，进行多重pcr扩增时，引物组包括引物对1至引物对22中的一种或几种；优选的，引物组对由引物对1至引物对22组成。pcr扩增的体系中，各引物对的浓度范围如下：引物对1:1.0-1.4μm；引物对2:0.8-1.2μm；引物对3:0.4-0.8μm；引物对4:0.4-0.8μm；引物对5: 0.8-1.2μm；引物对6:1.2-1.6μm；引物对7:1.2-1.6μm；引物对8:1.0-1.4μm；引物对9: 0.8-1.2μm；引物对10:1.0-1.4μm ；引物对11:0.6-1.0μm；引物对12:0.5-0.9μm；引物对13:0.3-0.7μm；引物对14:0.5-0.9μm；引物对15:0.6-1.0μm；引物对16:1.0-1.4μm；引物对17:1.2-1.6μm；引物对18:0.8-1.2μm；引物对19:1.0-1.4μm；引物对20:1.0-1.4μm；引物对21；0.8-1.2μm:引物对22:1.0-1.4μm。该浓度范围内的引物组合扩增的特异性好。

20、在本发明的一些优选方案中，在步骤（1）中，所述多重pcr体系为：20μl体系中，所述引物组中单个引物终浓度为0.5-1.5μm 4μl，总dna模板5μl，4×multiplex pcr mix（tris-hcl 25mm；kcl 30mm；mgcl23mm；tween20 0.06%；dmso 5.0%(v/v)；丙三醇4.0%；dntps 0.15mm ）5μl，去离子水补充至20μl。所述的多重pcr程序为：95℃预变性2min；循环1次，95℃变性15s；62℃退火加延伸2min；循环20次，4℃保存。

21、在本发明的一些实施方案中，步骤（2）中，所述添加接头的pcr扩增体系：上游引物2.5μl；下游引物2.5 μl；2×pcr mix 50μl；纯化后的连接产物23μl，去离子水补充至100μl。所述添加接头的pcr扩增程序：98℃预变性3min；循环1次，98℃变性10s；60℃退火15s；72℃延伸30s；循环10-20次，72℃终延伸5min；循环1次，4℃保存。在本发明的一些优选方案中，依据样本dna和制备文库的产量采用所需的循环数。

22、在本发明的一些实施方案中，步骤（2）中，对测序文库进行质控，片段大小为200-400bp，浓度>1ng/μl 的测序文库为合格测序文库，可用于高通量测序。在本发明的一些优选实施方案中，使用qubit 3.0测定文库浓度；使用qseq100分析文库片段大小。

23、在本发明的一些实施方案中，步骤（3）中，利用高通量测序平台对获得的测序文库进行测序，根据加上适用于不同平台的接头序列可使用包括但不限于illumina测序平台和华大测序平台对获得的测序文库进行测序。

24、在本发明的一些实施方案中，步骤（2）对多重 pcr 扩增产物进行纯化，去除扩增产物中杂质及非特异扩增片段，主要利用磁珠对所述多重pcr扩增产物进行选择性回收纯化。

25、在本发明的一些实施方案中，步骤（2）对连接后的产物进行纯化，去除连接产物中的杂质及非特异扩增片段，主要采用磁珠对所述产物纯化。

26、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

27、1、本发明提出了一种利用靶向测序技术准确，方便，快速，高通量的非诊断目的检测幽门螺杆菌耐药、毒力以及宿主cyp2c19基因多态性。在同一检测反应中获得个体hp的毒力因子信息、对抗生素的耐药情况以及宿主药物代谢类型，有利于及时根除幽门螺杆菌，提高幽门螺杆菌的根除率。

28、2、本发明将靶向测序(tngs)中多重pcr扩增与高通量测序两种技术结合，能够同时针对多个目的基因组区域进行遗传变异位点检测，获得指定目标区域的变异信息，尤其是对样品中低浓度的病原微生物检测，特别是其毒力和耐药基因检测。

29、3、本发明适合对大量样本进行快速、准确的检测分析，同时降低了单个样本的测序成本。

30、4、本发明与传统的一代(sanger)测序、宏基因组测序(mngs)技术相比，多重pcr的靶向测序技术在目标区域测序能够获得更深的覆盖度和更高的灵敏度，提高了目标区域的检测效率。