水稻抗褐飞虱基因BPH33.2及其分子标记和应用

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻抗褐飞虱基因bph33.2及其紧密连锁的分子标记，以及该分子标记在水稻褐飞虱抗性育种和品种改良方面的应用。

背景技术：

1、水稻(oryzasativa)是世界上最重要的粮食作物之一，其产量的稳定性对保障国民经济和人民生活至关重要。水稻作为禾本科的模式研究作物，其基因组相对较小，转基因技术非常成熟，功能基因组研究越来越深入。因此，在社会经济发展、国家安全和科学研究方面，水稻都显示出无可比拟的优越性和重要性。

2、褐飞虱(bph,nilaparvata lugens)是水稻种植区的最主要害虫。褐飞虱爆发力强、具迁飞性，危害面积大且危害程度深。褐飞虱已成为我国水稻安全生产的严重威胁。

3、目前，在生产上主要利用化学药剂防治褐飞虱。但是农药的滥用不仅增加农民的生产和人力成本，还对环境造成不可逆转的危害。同时，农药还能杀死褐飞虱的天敌，增强害虫的抗药性，反而诱发褐飞虱的再度猖獗。利用水稻抗性基因培育抗虫品种是目前最经济有效的防控策略。国际水稻研究所(irri)在防控褐飞虱的实践中证明，种植不同抗性的水稻品种能够有效地控制褐飞虱群体的疯狂增长，并在一定程度上减缓其生物型或致害性的变异速度，从而达到持久抗性的目的。因此，不断发掘和克隆新的抗性基因并应用于育种是解决褐飞虱综合防控的重点研究课题。此外，抗性基因的克隆和抗虫机制的阐明能丰富水稻功能基因组研究成果，确保我国在相关领域的世界领先水平。

4、自然界中存在丰富的抗褐飞虱的水稻种质资源，鉴定和克隆这些抗性水稻中的抗虫基因一直是科学家门研究的重点。截止到2022年，研究者已经鉴定出至少40个褐飞虱抗性基因或qtl，它们都来自野生稻和籼稻资源。随着水稻功能基因组研究的不断深入，一些褐飞虱抗性基因也被相继克隆。迄今，水稻中已经克隆了15个抗性基因。其中国内研究团队做出了主要的贡献，克隆了其中13个基因。武汉大学何光存教授团队在水稻中克隆了第一个抗褐飞虱基因，bph14，它编码一个螺旋-螺旋-核苷酸结合位点的亮氨酸重复的基序(cc-nb-lrr)，其独特的lrr区可能在褐飞虱侵入后的信号识别应答及激活防御反应上行使重要功能(duetal.2009pnas 106:22163-22168)。

5、此前，本研究室从irri引进了300余份可能对多种bph生物型具有抗性的品种或品系。通过对苗期抗性评价，我们筛选到了20多份高抗品种(hu et al.2016rice 11:55)。其中来自斯里兰卡的两个地方籼稻品种kolayal和poliyal在中国福州和武汉都对褐飞虱表现为高抗。为了从中定位抗性基因，我们构建了感虫品种9311和kolayal，9311和poliyal的bc1f2:3群体，利用极端混池测序法(bsa-seq)，同时在水稻第4染色体短臂(4s)上定位了一个新的抗性基因bph33.2。并通过重组单株分析将其精细定位在30kb的区域。通过候选基因分析和遗传转化验证，最终克隆了bph33.2。本发明通过正向遗传学的图位克隆方法，成功克隆了一个新的褐飞虱抗性基因，并开发了一系列与该抗性基因紧密连锁或共分离的分子标记，借助分子标记辅助选择(marker-assisted selection,mas)技术可以有目的地将抗虫基因精确导入或聚合，从而选用持久抗性品种，有效抑制褐飞虱种群数量，节约人工和农药成本，增加水稻产量。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种水稻抗褐飞虱基因bph33.2及其分子标记和应用，通过实验检测与这些抗性基因位点连锁或共分离的分子标记，可以在苗期就准确预测水稻植株的褐飞虱抗性，加快褐飞虱抗性水稻品种的选择进度。

2、本发明采用正向遗传学的方法，通过构建抗感材料的遗传群体，定位抗性基因bph33.2。通过遗传转化bph33.2基因，使感虫水稻出现抗褐飞虱表型；同时利用基因敲除bph33.2基因，使抗虫水稻丧失褐飞虱抗性表型，从而证实了bph33.2的功能。

3、本发明提供水稻抗褐飞虱基因bph33.2，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，该基因全长8,674bp，具有4个外显子和3个内含子，第一个外显子区段为2514-2778bp，第二个外显子区段为3456-3724bp，第三个外显子区段为4535-7732bp，第四个外显子区段为7940-8674bp。进一步地，所述水稻抗褐飞虱基因bph33.2的cdna全长4470bp，序列如seqid no.2所示，编码1072个氨基酸。本发明还提供了所述水稻抗褐飞虱基因bph33.2编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。

4、因为基因编码区的密码子存在简并性，故本发明还包含对编码上述蛋白的多核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列。

5、应当理解，在不影响bph33.2蛋白活性的前提下，本领域技术人员可对seq idno.3所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列，从而应用于水稻褐飞虱抗性的遗传改良。

6、本发明还提供了与水稻抗褐飞虱基因bph33.2紧密连锁的分子标记，由下述之一的引物对经常规pcr扩增获得：

7、1)标记引物h99，

8、左端引物序列，5’-cactgtggttacaacagaggt-3’

9、右端引物序列，5’-tctcttctcgttgctgctca-3’

10、2)标记引物h79，

11、左端引物序列，5’-ccgtgagttcacttgtaa-3’

12、右端引物序列，5’-gtacgatttgaccagcgag-3’

13、3)标记引物33-3，

14、左端引物序列，5’-cctcgcttacgaaattagtg-3’

15、右端引物序列，5’-tgtggcagagcaagaggg-3’

16、4)标记引物33-4，

17、左端引物序列，5’-gctttcggattatcttcacta-3’

18、右端引物序列，5’-agctccctaagctcaacca-3’

19、本发明还提供了鉴定水稻品种中是否含有bph33.2主效基因的分子标记方法，即用上述之一的引物对扩增待测水稻基因组dna，如果用引物h99能扩增出96bp的dna片段，或是h79能扩增出140bp的dna片段，或是33-3能扩增出330bp的dna片段，或是33-4能扩增出868bp的dna片段，均标志着水稻抗虫品种抗褐飞虱基因位点bph33.2的存在；如果用引物h99仅能扩增出112bp的dna片段，或是用引物h79仅能扩增出148bp的dna片段，或是用引物33-3不能扩增出任何dna片段，或是用引物33-4不能扩增出任何dna片段，均标志着水稻抗虫品种中不存在抗褐飞虱基因位点bph33.2。其中标记h99和h79为bph33.2基因物理位置两侧的紧密连锁标记，为共显性标记，即能够同时区分抗性纯合和杂合基因型；标记33-3和33-4是在bph33.2基因编码区内设计的特异的标记，为显性标记，即不能区分抗性纯合和杂合基因型，但是能区分感性纯合的基因型。

20、本发明提供一种利用转基因技术培育具有褐飞虱抗性的植物的方法，包括：

21、1)用含有bph33.2基因的多核苷酸转化植物愈伤组织的细胞；所述多核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示；

22、2)将被转化的植物细胞再生为植物；

23、3)培养再生的植物并使上述多核苷酸得到表达，收获t1代种子；

24、4)播种t1代种子，利用上述分子标记33-3和33-4检测bph33.2基因，并收获基因纯合的t2代种子。

25、本发明还提供一种利用常规育种(非转基因)产生具有褐飞虱抗性的植物的方法，所述方法包括将具有褐飞虱抗性基因bph33.2的植物与其他植物杂交产生具有褐飞虱抗性的子代植物。其中所述植物是单子叶植物。优选地，所述植物是水稻。

26、本发明的优点在于：

27、(1)本发明利用正向遗传学中的图位克隆方法成功克隆了一个水稻抗褐飞虱基因bph33.2，并验证了其在水稻抗褐飞虱上的功能。

28、(2)本发明的bph33.2基因是一个完全显性的抗虫基因，基因纯合或杂合对褐飞虱抗性没有显著差异，可以更好地应用于杂交水稻的抗虫育种中。

29、(3)bph33.2基因在水稻的苗期、分蘖期和成株期对褐飞虱都有很强的抗性，且对多个褐飞虱生物型和致害型，以及白背飞虱具有很好的抗性，这对于抗虫育种具有重要的意义。

30、(4)本发明中与抗性基因紧密连锁或共分离的分子标记可靠性高，鉴定方便。只要通过简单的实验检测这些分子标记，就可以准确预测水稻植株中褐飞虱抗性的存在与否，进而预测其褐飞虱抗性，不受环境影响，检测方便、快捷、高效。

31、(5)本发明可以提高常规育种的辅助选择效率，节约成本。通过分子标记检测水稻植株中的褐飞虱抗性基因位点，仅在苗期就能快速鉴定出高抗的单株，及时淘汰感虫单株，不仅节约生产成本，而且提高了抗性材料的选择效率，缩短水稻品种的育种周期。