与玉米RNAm5C的甲基化水平相关的蛋白质ZmSAM及其相关生物材料与应用

本发明涉及生物，特别涉及与玉米rna m5c的甲基化相关的蛋白质zmsam及其相关生物材料与应用。

背景技术：

1、玉米是全球主要种植的粮食作物。作为人类重要的营养来源以及牧畜饲料和生物能源加工的重要原料，玉米亩产的可持续增长对于保障全球粮食安全至关重要(jiang etal.,2020)。

2、目前，常规育种技术难以培育出复杂性状改良的突破性新品种，发展和完善新一代育种理论和技术体系是现代种业发展的迫切需求。表观遗传变异是作物农艺性状多样性的基础，主要通过表观修饰调控作物产量、品质、环境适应等方面，表观修饰主要包括组蛋白修饰、dna修饰、rna修饰(allis and jenuwein,2016)。以表观遗传学理论和技术为中心的精准表观育种打开了培育农作物全新路径的可能性。表观遗传调控植物响应逆境的分子机制虽然取得了一些进展，但是大部分的研究都集中在拟南芥和水稻上(liang et al.,2018；zhou et al.,2018)，玉米胁迫响应的表观遗传机制进展缓慢。在玉米表观遗传领域，表观修饰相关酶及表观遗传因子对玉米的生长发育和非生物胁迫等过程起着重要的作用。越来越多的研究表明，玉米发育相关的基因和蛋白家族会受到表观遗传修饰的影响，种子发育、形态变化、器官生长和生长过程也会随之受到影响。相比于水稻和拟南芥，玉米具有极其复杂的基因组，玉米中转座子的数量多且分布广泛。随着玉米参考基因组的进一步完善，玉米表观基因组学研究得以进一步发展，对玉米重要农艺性状的表观遗传机制研究也取得了广泛的进展。dna上胞嘧啶修饰、组蛋白h3k27me3、microrna和内源性小干扰rna(sirnas)可以协同调控玉米茎和根的发育(wang et al.,2009)。

3、rna甲基化是一种非常重要的表观遗传标记，在调控基因表达和mrna稳定性中发挥着重要的作用(cui et al.,2017；liang et al.,2020；zhang et al.,2022a)。rna甲基化调控着植物多个发育程序，如植物的胚胎发育(zhong et al.,2008)、叶片发育(arribas-hernández et al.,2018)、光合作用(zhang et al.,2022a)等。此外，rna甲基化对极端环境的变化会产生动态响应，植物在受到强光胁迫后，光合基因的m6a发生变化，m6a甲基化酶vir在强光条件下对维持植物光合效率起着重要作用，vir突变体植株在强光条件下光合效率减弱(zhang et al.,2022b)。而近年来在植物中发现rna的m5c修饰同样具有重要功能，参与植物基因表达、根发育、光合作用等多个方面(cui et al.,2017；david etal.,2017；zhang et al.,2022a)，是一个关键的表观遗传标记。mrna上的甲基化修饰主要由甲基化酶、去甲基化酶和识别蛋白动态调控(fu et al.,2014；zhang et al.,2022b)。rna修饰甲基化酶的缺失会导致植物发育的异常，如m6a甲基化酶的功能缺失导致植物向地性反应异常及分生组织异常增殖(arribas-hernández and brodersen,2020)，rna m5c甲基化酶缺失导致植物根系发育异常(cui et al.,2017)。研究发现rna m5c修饰调控水稻高温胁迫下的光系统修复(tang et al.,2020)，然而rna m5c修饰在玉米中的功能未被研究。

4、表观遗传修饰在玉米响应外界环境信号、调控基因的表达等发挥着重要的作用。然而，目前对玉米中rna m5c修饰的功能了解仍然较少，很多基础问题：如rna m5c修饰在不同玉米品种的特异性、动态性分布和调控发育的机制；rna m5c修饰在玉米响应环境信号中的分子机制等需要进行阐述。因此，研究玉米rna m5c表观修饰的分布模式和功能，可望获得具有创新性的调控玉米重要农艺性状的分子机制和获得重要的玉米基因资源，将为玉米抗逆高产的生产和育种提供重要理论基础。

5、综上所述，鉴定rna m5c调控的关键基因对研究rna甲基化在玉米中的作用及机制至关重要，同时将为揭示玉米表观遗传机制提供基础材料，并为优良玉米新品种的选育提供理论支撑，在分子育种上得到应用。

6、参考文献

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12、liang,z.,riaz,a.,chachar,s.,ding,y.,du,h.,and gu,x.(2020).epigeneticmodifications of mrna and dna in plants.molecular plant 13,14-30.

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16、zhang,d.,guo,w.,wang,t.,wang,y.,le,l.,xu,f.,wu,y.,wuriyanghan,h.,sung,z.r.,and pu,l.(2022a).rna 5-methylcytosine modification regulatesvegetative development associated with h3k27trimethylation inarabidopsis.advanced science(weinheim,baden-wurttemberg,germany)10,e2204885.zhang,m.,zeng,y.,peng,r.,dong,j.,lan,y.,duan,s.,chang,z.,ren,j.,luo,g.,liu,b.,et al.(2022b).n(6)-methyladenosine rna modification regulatesphotosynthesis during photodamage in plants.nature communications13,7441.

17、zhong,s.,li,h.,bodi,z.,button,j.,vespa,l.,herzog,m.,and fray,r.g.(2008).mta is an arabidopsis messenger rna adenosine methylase and interactswith a homolog of a sex-specific splicing factor.the plant cell 20,1278-1288.

18、zhou,c.,wang,c.,liu,h.,zhou,q.,liu,q.,guo,y.,peng,t.,song,j.,zhang,j.,chen,l.,et al.(2018).identification and analysis of adenine n(6)-methylation sites in the rice genome.nature plants 4,554-563.

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何调控玉米rna m5c的甲基化水平以调控玉米株高等表型。

2、为了解决上述技术问题，本发明首先提供一种蛋白质，所述蛋白质名为zmsam，为如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：

3、a1)氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质；

4、a2)将a1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由a1)衍生的或与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

5、a3)在a1)、a2)或a3)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

6、上述蛋白质中，所述蛋白质zmsam可来源于玉米。

7、上述蛋白质中，序列表中seq id no.2由875个氨基酸残基组成。

8、上文所述一个以上氨基酸残基具体可为十个以内的氨基酸残基。

9、上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％的同一性。

10、本发明还保护与蛋白质zmsam相关的生物材料，所述与蛋白质zmsam相关的生物材料，为下述b1)至b5)中的任一种：

11、b1)编码zmsam的核酸分子；

12、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

13、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；

14、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

15、b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系。

16、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

17、上述生物材料中，b1)所述核酸分子为编码序列是seq id no.1核苷酸的cdna分子或dna分子。

18、其中，序列表中seq id no.1由2628个核苷酸组成，编码seq id no.2所示的蛋白质。

19、上述生物材料中，b2)所述的含有所述核酸分子的表达盒(zmsam基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达zmsam的核酸分子，该核酸分子不但可包括启动zmsam基因转录的启动子，还可包括终止zmsam转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plant physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白质酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利20071 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白质、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)embo j.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature 313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plant cell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17:7891；joshi等人(1987)nucleic acid res.,15:9627)。

20、上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

21、本发明还提供降低所述蛋白质zmsam活性或含量的物质，或抑制或降低所述蛋白质zmsam的编码基因表达物质的应用，所述应用为下述任一种：

22、p1、在降低玉米rnam5c甲基化水平中的应用；

23、p2、在降低玉米株高中的应用；

24、p3、在缩短玉米节间距中的应用；

25、p4、在减少玉米叶片绿色程度中的应用；

26、p5、在玉米育种中的应用。

27、上述应用中，所述蛋白质zmsam可来源于玉米。

28、上述应用中，所述蛋白质zmsam的编码基因可为如下a1)或a2)或a3)所示的dna分子：

29、a1)编码序列是序列表中seq id no.1所示的dna分子；

30、a2)与a1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码上文所述蛋白质zmsam的dna分子；

31、a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上文所述蛋白质zmsam的dna分子。

32、上述应用中，所述调控所述蛋白质zmsam的编码基因可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

33、上述应用中，降低蛋白质zmsam活性或含量的物质可为敲除所述蛋白质zmsam的编码基因的物质，和/或抑制或降低所述蛋白质zmsam的编码基因表达的物质。

34、上述应用中，抑制或降低所述蛋白质zmsam的编码基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

35、所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。

36、所述基因沉默是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默,另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活，包括反义rna、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。

37、上述应用中，所述抑制或降低所述蛋白质zmsam的编码基因表达可为抑制或降低所述基因表达的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可为敲除所述基因的试剂，如通过同源重组敲除所述基因的试剂，或通过crispr-cas9敲除所述基因的试剂。所述抑制或降低所述基因表达的试剂可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。

38、上述应用中，降低蛋白质zmsam活性或含量的物质，或抑制或降低所述蛋白质zmsam的编码基因表达的物质，可为如下c1)-c4)任一种物质：

39、c1)抑制或降低所述蛋白质zmsam编码基因表达的核酸分子；

40、c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；

41、c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；

42、c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。

43、c1)所述的核酸分子可为表达靶向上文所述所述蛋白质zmsam编码基因表达的sgrna或表达所述sgrna的dna分子。

44、所述sgrna的靶序列为seq id no.3的第7540-7561位。

45、为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种降低玉米rnam5c甲基化水平的方法，包括通过抑制或降低玉米基因组中所述蛋白质zmsam的编码基因的表达量来降低玉米rna m5c甲基化水平。

46、上述抑制或降低玉米基因组中所述蛋白质zmsam的编码基因的表达量可采用现有技术中的任何方式实现，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而实现基因功能降低或丧失，具体可为化学诱变、物理诱变、rnai、基因组定点编辑或同源重组等。

47、上述基因组定点编辑方法中，可采用锌指核酸酶(zinc finger nuclease,zfn)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,talen)技术或成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/crispr associated，crispr/cas9system)技术，以及其它能实现基因组定点编辑的技术。无论采取哪种方法，既可对上文所述蛋白的整个编码基因作为靶标，又可将调控上文所述蛋白编码基因表达的各个元件作为靶标，只要能实现基因功能丧失或降低即可。如可以将上文所述蛋白的编码基因的外显子或5’utr等作为靶标。

48、上文所述方法中，所述抑制或降低玉米基因组中所述蛋白质zmsam的编码基因的表达量可为向玉米中导入如下c1)-c4)任一种物质：

49、c1)抑制或降低上文所述蛋白质zmsam编码基因表达的核酸分子；

50、c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；

51、c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；

52、c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。

53、c1)所述的核酸分子为靶向上文所述蛋白质zmsam编码基因的sgrna或表达所述sgrna的dna分子。

54、所述sgrna的靶序列为seq id no.3的第7540-7561位。

55、所述抑制或降低玉米基因组中所述蛋白质zmsam的编码基因的表达量为将玉米基因组中的seq id no.3所示的所述蛋白质的编码基因进行下述突变：

56、在seq id no.3的第7556位至7557位间插入了核苷酸g。

57、本发明公开了对玉米zmsam基因进行敲除，降低玉米rna m5c甲基化水平的方法。具体利用crispr/cas9系统对出发玉米中zmsam基因进行编辑，且使所述zmsam基因发生突变导致翻译蛋白提前终止，得到转基因玉米，实现出发玉米中zmsam基因编辑。本发明利用crispr/cas9介导的基因编辑技术对玉米zmsam基因进行特定靶点的定点敲除，获得rnam5c甲基化水平降低的玉米突变体材料，为玉米品种选育提供新材料。