一种能高效利用非天然辅因子的P450BM3酶突变体及其表达应用

本发明涉及生物工程，具体而言，涉及一种能高效利用非天然辅因子的p450bm3酶突变体及其表达应用。

背景技术：

1、细胞色素p450酶(cyp102a1，ec1.14.14.1)是一类含铁蛋白家族，在还原状态下此酶可以与co相结合，并且在450nm波长处有一最大吸收峰，因此命名为p450(冷欣夫,邱星辉,细胞色素p450酶系的结构、功能与应用前景[m].科学出版社:2001)。p450酶在自然界中广泛存在，是药物代谢过程中的关键氧化还原酶，可以催化各种各样的反应，具有显著的底物特异性和高度效能(t.k.hyster,f.h.arnold.p450bm3-axial mutations:a gateway tonon-natural reactivity[j].israel journal of chemistry.2015,55(1),14-20)。

2、细胞色素p450bm3是第三个从bacillus megaterium中分离出来的p450酶，因此被命名为p450bm3。p450bm3酶是fulco等人在七十年代初发现的，被鉴定为一种可溶性中链和长链脂肪酸羟基酶，需要nadph和氧气才能发挥作用(y.miura,a.j.fulco.(ω–2)hydroxylation of fatty acids by a soluble system from bacillus megaterium[j].journal of biological chemistry.1974,249(6),1880-8)。细胞色素p450bm3酶是电子自给自足型氧化还原酶，分为heme结构域和cpr结构域(c.j.c.whitehouse,s.g.bell,l.-l.wong.

3、p450bm3(cyp102a1):connecting the dots[j].chemical societyreviews.2012,41(3),1218-1260)，cpr结构域又分为fmn结构域、fad结构域、fad/nadph结合域。p450bm3酶中的电子从nadph到fad的第一次转移形成fadh2。接下来，电子从fadh2传递到fmn，导致同时形成fmnh和fadh半醌。最后一步是在血红素域中从fmnh半醌向铁提供电子(m.b.murataliev,r.feyereisen,f.a.walker.electron transfer by diflavinreductases[j].biochimica et biophysica acta(bba)-proteins andproteomics.2004,1698(1),1-26)。电子传递过程如图1所示。

4、p450 bm3酶在进行工业催化过程中，需要nad(p)h为其提供电子，但nad(p)h使用成本高、结构复杂、不稳定等因素给工业生产带来了诸多障碍(j.d.ryan,r.h.fish,d.s.clark.engineering cytochrome p450 enzymes for improved activity towardsbiomimetic 1,4-nadh cofactors[j].chembiochem.2008,9(16),2579-2582)。为解决这一问题，许多研究人员从p450 bm3酶在电子转移中的自给性和立体选择性方面着手，采用蛋白质工程策略来获得p450bm3突变体(s.kille,f.e.zilly,j.p.acevedo,m.t.reetz.regio-and stereoselectivity of p450-catalysed hydroxylation ofsteroids controlled by laboratory evolution[j].nature chemistry.2011,3(9),738-743)。例如，munro小组证明p450 bm3酶的a82f，f87v和f87v/a82f突变体可以更有效地催化伏立康唑，奥美拉唑和埃索美拉唑等各种唑类抗真菌药(l.n.jeffreys,h.poddar,m.golovanova,c.w.levy,h.m.girvan,k.j.mclean,m.w.voice,d.leys,a.w.munro.novelinsights into p450 bm3 interactions with fda-approved antifungal azole drugs[j].scientific reports.2019,9(1),1577.)。arnold小组可以完成nad(p)h驱动的环丙烷转移，在全细胞催化中具有很高的转化率(p.s.coelho,z.j.wang,m.e.ener,s.a.baril,a.kannan,f.h.arnold,e.m.brustad.a serine-substituted p450 catalyzes highlyefficient carbene transfer to olefins in vivo[j].nature chemicalbiology.2013,9(8),485-487)。但是，野生型(wt)p450bm3酶仅消耗天然辅酶提供的电子，这无疑阻碍了酶的利用。因此，目前人们开发并利用了许多结构更简单的仿生辅因子，例如烟酰胺单核苷酸(nmn+/nmnh)。但是，大多数野生型酶或者不能利用仿生辅助因子，或者是在利用此类辅助因子时表现出低活性。

5、p450bm3酶是一种高效的天然生物催化剂，主要催化生物体的氧化和还原反应，在食品、医药、废物处理等行业广泛使用，推动了高效、经济、绿色的工业发展。生物体的生长、代谢、繁殖等生命活动都与氧化还原反应具有非常密切的关联，如此重要的氧化还原酶在工业生产中的应用地位也无可替代。

6、细胞色素p450bm3氧化还原酶主要催化生物体的氧化和还原反应，生物体的生长、代谢、繁殖等生命活动都与氧化还原反应具有非常密切的关联。在药物合成、食品加工等行业中也有十分广泛的应用。在催化过程中细胞色素p450bm3酶都需要天然的辅因子，例如nadh和nadph。然而，这些天然辅因子成本高、结构复杂且不稳定，会增加工业生产的成本和障碍。因此，目前人们开发并利用了许多结构更简单的仿生辅因子烟酰胺核苷酸(nmnh)。仿生辅因子nmnh的结构比nadph简单，合成容易、物质稳定且成本低。但是，大多数野生型酶或者不能利用仿生辅助因子，或者是在利用此类辅助因子时表现出低活性，无法满足工业发展的需求。

7、因此，对p450bm3酶进行突变改造，获得能够高效利用仿生辅因子nmnh的优势突变体是解决这个问题的关键。

技术实现思路

1、本发明的目的，就是为了解决上述问题而提供了一种能高效利用非天然辅因子的p450bm3酶突变体，通过对p450bm3酶的序列、结构和功能进行深入研究，建立异源表达系统，选择仿生辅因子nmnh替代天然辅酶nad(p)h，对p450bm3酶进行突变，获取能够高效利用仿生辅因子nmnh的突变菌种。

2、本发明的目的是这样实现的：

3、本发明提供了一种能高效利用非天然辅因子的p450bm3酶突变体，其氨基酸序列如seq id no.3或seq id no.5所示。

4、编码上述能高效利用非天然辅因子的p450bm3酶突变体的基因。

5、本发明提供了一种重组表达载体，其包含如seq id no.4或seq id no.6所示的核苷酸序列。

6、还提供了一种宿主细胞，其包含上述的重组表达载体。

7、本发明还提供了能高效利用非天然辅因子的p450bm3酶突变体基因在分泌表达p450bm3酶突变体中的应用。

8、如图2所示，p450bm3酶中的电子传递过程是从nadph/nmnh的c-4的氢负离子到fad的n-5。基于此，本发明以pdb编号1j9z与4dql为结构模板，以fad黄素的n-5原子与nmnh的c-4原子之间的距离为改善催化效率的基础进行理性设计提高p450bm3酶利用仿生辅因子nmnh的活性。将848号位点的丝氨酸突变为精氨酸、1047号位点的色氨酸突变为丝氨酸、906号位点的苏氨酸突变为丙氨酸，得到了相对酶活性提高了1633.73u·mg-1的s848rw1047st906a突变体；将848号位点的丝氨酸突变为精氨酸、1047号位点的色氨酸突变为丝氨酸、906号位点的苏氨酸突变为丝氨酸，得到了相对酶活性提高了1445.2u·mg-1的s848rw1047s t906s突变体，两个突变体均能能够高效利用仿生辅因子nmnh，大大降低了工业生产的成本和障碍。