检测人细小病毒B19的双靶标引物探针组、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及基因检测，特别涉及一种检测人细小病毒b19的双靶标引物探针组、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、人细小病毒b19(human parvo virus b19，简称b19v)是已知的最小病毒，属于细小病毒科，无包膜，核心为线状单链dna。b19v可被分为1、2、3三种基因型，基因型1与基因型2和基因型3核酸差异率约为10％，基因型与疾病无特定关系。人细小病毒b19感染呈全球性分布，人群感染率高达60％～70％以上。传播途径主要有飞沫、皮肤接触、血液、血液制品或由胎盘垂直传播。b19v新近感染可在各年龄段中发生，急性感染在6-15岁个体中最常出现。儿童感染后最常引发传染性红斑，免疫力正常人群感染后一般为轻型自限性症状。孕妇感染可造成胎儿水肿和先天性贫血，严重时导致胎儿死亡。先天免疫缺陷患者、艾滋病患者、肿瘤或器官移植手术后进行化疗的患者感染会导致慢性贫血症。镰状细胞贫血症等血液系统疾病患者感染会发生再生障碍性危象而导致急性贫血。部分感染患者会出现关节疼痛等症状，随后演变为多发性关节炎。此外，某些肾病、肝炎、神经性疾病、心肌损伤和一些自身免疫疾病等病例也可能与b19v的感染有关。

2、人细小病毒b19可通过输血、血液制品传播。由于接受输血和应用血液制品的人群常常有免疫缺陷或其它疾病存在，病毒感染后更容易加重疾病进程或者导致并发症。因此，血液、血制品检测也具有重要的临床意义。近年来，国际组织和发达国家等对于原料血浆及血液制品中b19v的污染均采取监控措施。国际血浆蛋白治疗协会(ppta)在2003年要求：混合血浆中b19v dna含量应≤105iu/ml；并将核酸检测技术(nucleic acid amplificationtechnology，nat)作为检测b19v病毒载量的在线控制措施。美国食品与药品监督管理局(fda)于2009年建议混合血浆中b19v的含量控制在104iu/ml以内，将nat方法作为在线控制措施；并且要求nat技术能检出b19v的全部基因型(即能同时检出b19v的三种基因型)。

3、检测人细小病毒b19感染的常用方法有血清学抗体检测和pcr病毒核酸检测，其中b19v血清学抗体检测是目前进行临床辅助诊断和流行病学调查的主要方法。然而，不同人群感染b19v后会产生不同强度的免疫应答反应，健康成年人感染b19v后抗体反应非常强，能检测到高滴度的特异性igm抗体；而对于b19v感染引起传染性红斑的儿童，其抗体反应很弱；当患有溶血性贫血儿童感染b19v并发生再障危象时，igm抗体反应则特别强。因此，检测igm对于儿童急性感染b19v的诊断不是一种可靠手段。此外，免疫力缺陷者体内可能检测不到b19v抗体，不能仅仅依靠抗体反应进行b19v感染的诊断，需要对b19v本身进行检测。

4、pcr病毒核酸检测可直接在血液、骨髓和其他器官(如肾脏、肝脏和肺脏)的临床标本中进行b19v dna的定性或定量检测，显著提高了b19v dna的检出率和准确性，适用于各类人群。有研究表明，无症状者在急性感染1年后复查仍可检测到b19v；此外b19v高病毒载量可能与感染及临床症状的严重程度有关，因此b19v定性检测的临床价值要显著低于定量检测。

5、随着pcr等扩增技术的发展，越来越多的国内外厂家也设计了不同类型的试剂盒来执行血液或者血清产品的b19v检测，中国发明专利cn103820581b授权了一组用于检测b19v的引物探针组，其利用凝胶电泳分析法从扩增子产物长度进行筛选，获取了一组引物探针组进而执行pcr扩增和熔解度曲线分析，得出了其设计的引物探针组具有较高灵敏度特性；中国发明专利cn105886665b授权了一组引物探针组与其他三项靶标组合形成的四重pcr扩增检测试剂盒，这种设计由于在单个容器中执行扩增因此需要设计出相互之间竞争干扰小的引物探针组；欧洲发明专利申请ep1799856a2也公开了一种b19、v9和a6组合形成的人类红细胞病毒联合检测的方案，其探索了三种病毒的共性核酸片段区，基于此设计了相应的检测试剂盒以进行更全面的检测；与此类似中国发明专利申请cn115961089a和cn115961100a也公开了使用一组引物探针组进行b19v检测的试剂盒具体检测区域未明确；韩国发明专利kr101446728b1授权的发明专利对于重叠区的vp1和vp2蛋白编码区进行探索，比较获得了这两个重叠区域中相对更适宜b19v检测的引物探针组；美国授权发明专利us11242571b2则从pcr预混液成分的改变和限定角度保护了一种更高灵敏度检测的b19v检测试剂盒。上述这些专利基本上都是单靶标基因的检测，这种设计虽然比较简单但是对于b19不同亚型存在漏检可能性，而b19v基因序列本身突变频率较高且不同基因型基因序列差异较大，因此检测过程中更增加了漏检的风险。

6、因此亟待开发一种能够检测人细小病毒b19不同亚型的引物探针组合检测方法，来弥补漏检可能导致的感染风险。

技术实现思路

1、本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种检测人细小病毒b19的双靶标引物探针组、试剂盒及检测方法，以克服现有技术所存在的问题。

2、本发明采用的技术方案如下：一种检测人细小病毒b19的双靶标引物探针组，包含vp1蛋白编码区的第一引物探针组和ns1蛋白编码区的第二引物探针组，所述第二引物探针组对应的扩增子位于ns1蛋白编码区的1/2-4/5。

3、进一步，所述第一引物探针组对应的扩增子与所述第二引物探针组对应的扩增子之间间隔碱基数不小于1kb。

4、进一步，所述第一引物探针组对应的扩增子位于vp1蛋白编码区的1/5-1/2。

5、进一步，所述第一引物探针组对应的扩增子在人细小病毒序列(ncbi人细小病毒序列nc_000883.2，13-aug-2018)的起止位点为：3212-3344；所述第二引物探针组对应的扩增子在人细小病毒序列的起止位点为：2011-2158。

6、进一步，现有常规针对人细小病毒b19的检测大多以单个基因作为检测靶标，本发明在单靶标基因检测的基础上，选择人细小病毒b19的vp1基因和ns1基因进行双靶标基因检测。通过有效测试确定ns1基因扩增子区域的起止位点为：2011-2158(这个扩增子安排在ns1区域的后半段，具体位于ns1区域的1/2-4/5，具有较高的稳定特性；同时，相比前半段而言能够覆盖更多亚型)。vp1基因扩增子区域的起止位点为：3212-3344(这个扩增子包含了vp2的起始位点3305，从位置来看其位于vp1蛋白编码区的前半段，即位于vp1蛋白编码区的1/5-1/2区域内。由于前半段包含了vp1和vp2的编码起点因此相对于后半段其突变的概率更小，碱基序列稳定性更高；从进化角度分析，如果这一区域突变概率较高则极大可能导致难以编译vp1和vp2蛋白。因此，vp1扩增子安排在这一区域稳定度更高，也能更全面识别出不同病毒亚型)。ns1和vp1扩增子二者之间碱基数超过1kb，通过优化pcr扩增程序中退火延伸时长，规避了两个检测靶标之间的相互干扰作用，更有效避免由于单个基因突变而造成的假阴性结果；另一方面，采用双靶标检测基因组合设计对人细小病毒b19的检出限显著优于单靶标检测，能够提高待测样本的阳性检出率。

7、进一步，所述第一引物探针组包含：

8、vp1的上游引物：5’-tttactttaaaaggtgcagctgcc-’3；

9、vp1的下游引物：5’-ctgcaccagtgctggcttc-’3；

10、vp1的探针：5’-cccctgtggcccattttcaaggaag-’3；

11、所述第二引物探针组包含：

12、ns1的上游引物：5’-tggtgtaatgcacaaagctgg-’3；

13、ns1的下游引物：5’-caccaccactgctgctga-’3；

14、ns1的探针：5’-ccactatgaaaactgggcaataaacta-’3。

15、进一步，所述ns1的探针的5’端标记为fam荧光发生基团，其3’端标记为mgb；所述vp1的探针的5’端标记为fam荧光发生基团，3’端标记为bhq1。

16、本发明分别针对vp1基因和ns1基因设计了高度特异的引物组，该引物组合中的引物之间不存在互补配对的缺陷，有效避免了引物二聚体条带对扩增产物的影响，减少了引物之间的消耗，提高了扩增效率，增加成功率；同时极大的提高对b19v的检出限，具有强敏感性。

17、进一步，本发明还包括一种检测人细小病毒b19的试剂盒，试剂盒包含上述双靶标引物探针组。

18、进一步，所述试剂盒还包含内标引物探针组，所述内标引物探针组包含：

19、内标的上游引物：5’-cggacattctatctgcttatgcaa-’3；

20、内标的下游引物：5’-gatctgcctactcaaagctaagtg-’3；

21、内标的探针：5’-atcccactcccgcttttgtccccaa-’3。

22、进一步，所述内标的探针的5’端标记为cy5荧光发生基团，3’端标记为bhq2。

23、进一步，双靶标引物探针组中的探针终浓度为100-200nmol/l，其引物终浓度为100-200nmol/l；内标引物探针组中的探针终浓度为100-200nmol/l，其引物终浓度为100-200nmol/l。

24、进一步，所述试剂盒还包括b19v-pcr预混液、b19v定量标准品1-4、b19v内标质控品、b19v阴性质控品、b19v临界阳性质控品、b19v强阳性质控品；

25、所述b19v-pcr预混液包括双靶标引物探针组、内标引物探针组、酶混合液、pcr缓冲液；

26、pcr缓冲液组成为50-100mol/l的tris-hcl(优选ph值为8.3)，10-30mmol/l的(nh4)2so4，30-50mmol/l的kc1，1.5-3.0mmol/l的mgcl2，0.10-0.50mol/l的dntps；

27、酶混合液包括热启动hs taq酶、尿嘧啶糖基化酶(ung)；其中taq酶的用量为2-5u/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.1u/人份；

28、b19v定量标准品1-4由含有b19v双靶标基因片段的假病毒制备而成，浓度分别为1.0×103iu/ml-5.0×103iu/ml、1.0×104iu/ml-5.0×104iu/ml、1.0×105iu/ml-5.0×105iu/ml、1.0×106iu/ml-5.0×106iu/ml；

29、b19v临界阳性质控品以及b19v强阳性质控品均由灭活b19v阳性血清样本稀释而成，浓度分别为100iu/ml和1.0×105iu/ml；

30、b19v阴性质控品为灭活b19v阴性血清样本，b19v内标质控品由含内标基因片段的假病毒制备而成。

31、进一步，本发明还包括一种上述试剂盒的检测方法，包含将所述试剂盒加入包含靶标的提取纯化液，添加b19v pcr预混液形成待扩增体系，按以下程序对待扩增体系进行pcr扩增：

32、50℃2min，1个循环；

33、95℃3min，1个循环；

34、95℃3s，60℃30s，45个循环，采集荧光信号。

35、进一步，上述检测方法可具体包括如下步骤：

36、a、样本处理：建议使用西安天隆科技有限公司的全自动核酸提取仪及其配套试剂盒核酸提取或纯化试剂进行提取，每份提取添加500μl样本以及10μl b19v内标质控品，试剂盒中b19v定量标准品、b19v临界阳性质控品、b19v强阳性质控品和b19v阴性质控品按照样本处理；

37、b、试剂配制：从检测试剂盒中取出b19v pcr预混液，在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec，计算所需反应试剂测试量n[n＝样本数+对照数(3)+定量标准品数(4)]，按20μl量分装到pcr薄壁管中，然后转移到样本处理区；

38、c、加样：按一定顺序向预混液中分别加入20μl的定量标准品、b19v阴性质控品、b19v临界阳性质控品、b19v强阳性质控品和待测样品的洗脱液，盖紧反应管，转移至pcr扩增区；

39、d、pcr扩增及荧光检测：将各反应管按一定顺序放入荧光定量pcr仪上，按以下程序进行pcr扩增：50℃2min，1个循环；95℃3min，1个循环；95℃3s，60℃30s，45个循环，采集荧光信号。

40、综上所述，本发明提供了一种人细小病毒b19的快速超敏定量检测试剂盒和方法，该方法是通过磁珠法提取人细小病毒b19核酸，利用双靶标基因中高度保守区域设计引物和探针和实时荧光定量pcr技术，实现高灵敏度、高准确性、快速便捷检测人细小病毒b19核酸，相对于现有技术具有以下有益效果：

41、1、利用双靶标基因ns1和vp1中高度保守区域分别设计引物和探针，可全面覆盖人细小病毒基因型1-3，多重靶标检测可减少高频率突变造成漏检的风险，也可以避免由于低浓度临床样本中b19v核酸基因组不全导致假阳性；同时，对可能存在交叉病原体或者细菌所有序列进行比对分析，确保多重引物探针高度特异；

42、2、利用自主研发的磁珠法核酸提取技术以及配合全自动核酸提取仪，实现大样本量提取并保证核酸纯度和浓度，同时减少样本中干扰物对pcr扩增效率抑制，试剂盒检测灵敏度为10iu，检测线性范围为20-5×108iu/ml，高度灵敏度和宽线性范围，更适合原料血浆及相关生物制品检测；

43、3、内标选用一段与人细小病毒b19目标基因无干扰的人工合成序列设计特异引物和探针，探针选用cy5通道荧光标记，从而实现在全封闭反应体系中对检测过程的监控，可有效监控假阴性的发生；同时，体系加入ung酶防污染体系；

44、4、试剂盒采用pcr预混液形式，含有dna聚合酶、盐、镁、dntps、引物探针等混合物，可用于有效的pcr扩增，只需添加模板，从而减少了pcr反应构建过程中的移液步骤数；

45、5、试剂盒搭配核酸检测流水线平台，可实现高效、高通量、高智能化检测，减少了人工，降低了操作误差；

46、6、试剂盒可用于b19v感染人员体内病毒载量的动态监测，评估药物疗效；同时可用于原料血浆或血液制品中b19v的污染，对血液制品的病毒安全性具有重要价值。