一种高灵敏血浆游离核酸提取试剂盒、提取方法和应用与流程

本发明属于生物，更具体地，涉及一种高灵敏血浆游离核酸提取试剂盒、提取方法和应用。

背景技术：

1、游离dna(circulating cell-free dna，cfdna)是游离于细胞外的部分降解的dna片段，存在于人体的各种体液如血液、尿液、唾液、脑脊液等体液中。cfdna一般起源于坏死、凋亡的细胞或肿瘤细胞，通常认为健康人体血浆cfdna中180bp左右的dna片段含量较高，而癌症患者血浆cfdna中150bp左右的片段dna含量较高，孕妇中胎儿的dna大小在313-798bp，且在特定的生理条件或者疾病发生、发展过程中，cfdna能够随着组织损伤、癌症和炎症反应等发生浓度变化。目前cfdna已被广泛应用于实体器官移植后的组织排斥反应、妊娠期间胎儿非整倍体的无创产检和癌症早筛等领域。

2、现有研究表明，肿瘤患者cfdna浓度水平与肿瘤阶段、大小、位置、治疗及预后因素有关。近年来，在肿瘤治疗过程中，通过监测血液cfdna的动态变化或甲基化、突变来监测病情发展也得到临床医生的广泛重视。但血浆cfdna分子片段小(通常认为血浆cfdna主要分布在100-220bp)、浓度低且半衰期短(一般在0.5-2小时)，因其提取困难且容易受基因组dna的影响，对检测方法的灵敏度和准确性要求高。

3、目前，血浆cfdna的检测方法主要为硅膜离心柱吸附法和磁珠吸附法。离心柱吸附法提取核酸纯度较高，且操作复杂用时较长，需要多次高速离心，更换离心管等，无法适配高通量的提取仪器。磁珠吸附法由于能够与核酸自动提取仪配套使用实现高通量提取，是现有cfdna提取研究的一个主要方向，如专利cn 107663521a血浆游离核酸提取试剂盒及其应用，该试剂盒主要是提取小于100bp和大于200bp的血浆核酸；专利cn114058616a一种基于磁珠法快速提取血浆游离核酸的试剂盒，该试剂盒主要是提取小于100bp和300bp的血浆核酸。虽然市售qiagen循环核酸试剂盒能够提取大小在100-220bp的dna，但是其对血浆cfdna的检测灵敏度和提取率较低，一般获得的目标dna含量较低难以达到下游直接检测的要求。因此，研究一种高灵敏磁珠法提取血浆cfdna的提取试剂盒，利于提高对cfdna的提取率和检测准确性，尤其是对大小在100-220bp的cfdna，进而提高基于cfdna的体外诊断的准确性。

技术实现思路

1、针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种高灵敏血浆游离核酸提取试剂盒、提取方法和应用，其目的在于意外发现2-5m的盐酸胍、1-4％的十二烷基硫酸钠硫酸钠、10％的peg6000(聚乙二醇)、10-50mm的edta(乙二胺四乙酸)、10-100mm的tris(三羟甲基氨基甲烷)、体积占比40-80％的异丙醇、体积占比1-4％的np-40(乙基苯基聚乙二醇)的裂解结合液，以及粒径范围为40-200nm，含量为10-100mg/ml的硅羟基磁珠，二者配合对大小在100-220bp的血浆cfdna的结合提取能力强且检测灵敏度可达1ng/ml，其制备成的提取试剂盒能够提取多种大小在100-220bp的血浆cfdna和300bp以上的cfdna，其中对大小在150bp左右和180bp左右的cfdna片段提取率分别可达98％和90％且对血浆cfdna提取量高于市售qiagen循环核酸试剂盒，由此解决现有血浆cfdna提取试剂盒对游离dna检测灵敏度和提取量较低的技术问题。

2、为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种高灵敏血浆cfdna提取试剂盒，其包括裂解结合液、硅羟基磁珠悬浮液；

3、所述裂解结合液包括2-5m的盐酸胍、1-4％的十二烷基硫酸钠、10％peg、10-50mm的edta、10-100mm的tris、体积占比40-80％的异丙醇、体积占比1-4％的np-40；

4、所述硅羟基磁珠悬浮液，磁珠粒径范围为40-200nm，含量为10-100mg/ml。

5、优选地，所述高灵敏血浆cfdna提取试剂盒，其所述裂解结合液为3-4m的盐酸胍、2-3％的十二烷基硫酸钠、10％peg、30-50mm的edta、50-100mm的tris、40-80％的异丙醇、体积占比2-3％的np-40；所述硅羟基磁珠悬浮液，磁珠粒径范围为100-200nm，含量为50-100mg/ml。

6、优选地，所述高灵敏血浆cfdna提取试剂盒，其所述高灵敏血浆cfdna提取试剂盒，还包括carrier rna，所述carrier rna含量在0.3-1μg。

7、优选地，所述高灵敏血浆cfdna提取试剂盒，其还包括蛋白酶k溶液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液。

8、优选地，所述高灵敏血浆cfdna提取试剂盒，其所述洗涤液1包括2-4m的盐酸胍、10-100mm的tris、1-10mm的edta、体积占比1-4％的np-40、体积占比30-60％的异丙醇；所述洗涤液2包括体积占比70-80％的乙醇、10-100mm的tris-hcl，ph为7.5-8。

9、优选地，所述高灵敏血浆cfdna提取试剂盒，其所述洗脱液包括1-10mm的乙二胺四乙酸二钠、10-100mm的tris-hcl，ph为7.5-8。

10、按照本发明的另一方面，还提供了一种血浆cfdna的提取方法，其采用如本发明所述高灵敏血浆cfdna提取试剂盒进行提取。

11、优选地，所述血浆cfdna的提取方法，其具体包括以下步骤：

12、取1-3ml血浆样本，加入1.5-4.5ml裂解结合液和20-60μl硅羟基磁珠进行裂解结合，混匀后30-40℃孵育20-30min，吸磁，弃掉液体，获得裂解结合混合物，经洗涤、洗脱后即为提取的目标cfdna，所述目标cfdna包括大小在100-220bp的cfdna。

13、优选地，所述血浆cfdna的提取方法，其在裂解结合时还添加0.3-1μg carrierrna和100-500μl蛋白酶k溶液。

14、按照本发明的另一方面，还提供了一种如本发明所述高灵敏血浆cfdna提取试剂盒在制备基于cfdna的体外诊断试剂中的应用，其所述基于cfdna的体外诊断试剂包括癌症早筛试剂或无创产检检测试剂。

15、总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

16、本发明提供的高灵敏血浆cfdna提取试剂盒，由于该裂解结合液中1-4％的十二烷基硫酸钠(sds)能够使游离dna和蛋白质离析释放出纯的cfdna，但是对细胞膜的破环强度较弱，利于减少基因组dna被释放出来；另外在10-50mm的edta和2-5m的盐酸胍的协同作用下能够快速有效抑制核酸酶，可同时避免细胞内基因组dna和细胞外游离dna被降解，影响不同片段大小cfdna检测的准确性；而体积占比40-80％的异丙醇和体积占比1-4％的np-40利于提取纯的cfdna。实验结果表明，本发明提供的血浆cfdna提取试剂盒对100-220bp的cfdna的结合提取能力强且其检测灵敏度可达1ng/ml，其对cfdna的提取率和检测准确性高于市售血浆游离dna提取试剂盒，其中对150bp左右和180bp左右的cfdna片段提取率分别可达98％和90％，利于提高癌症早筛的准确性，市场应用前景广阔。