一种基于可调DNA支架网络的纳米通道传感器及其制备方法与应用

本发明属于纳米材料检测应用，具体涉及一种基于可调dna支架网络的纳米通道传感器及其制备方法与应用。

背景技术：

1、仿生智能纳米传感器的快速发展构成了一个原理验证的体外平台，可以模仿生命体中离子传输的过程，拓展更多在检测中的实际应用尝试。固态纳米通道作为优异的生物离子通道仿生产物可以提供离子电流作为信号，用于监测生物反应，例如特定识别，与外部刺激的反应等。此外，纳米通道/纳米孔为功能分子和分析物之间的相互作用提供了一个纳米尺度的受限领域，产生了反应物在纳米通道/纳米孔中轻松频繁地传输的动力学效应。由于纳米通道的通道狭窄，其间的离子传输受到纳米通道表面状态的影响，如电荷分布、组成和润湿性等。因此在固态纳米孔的外表面引入一些功能分子可以精细调节孔道内的离子传输。由于单纯的纳米孔道检测缺乏对靶标物质的特异性，所以在纳米孔道表面修饰功能化器件成为越来越多人的选择。核酸分子因特异性的沃森克里克作用在纳米通道检测功能化中倍受亲睐。除了可以特异性识别靶标之外，还可以利用核酸探针自带的负电荷改变纳米孔道表面的电荷密度调节离子电流强度，因此也可以使用常规的核酸信号放大技术增加分析物检测的信号，降低检出限。然而目前的信号扩增技术拥有固定的检出限，不能精准调控分析物的检测范围，缺少一种梯度控制纳米孔道检测检出限及标准曲线的方式，对于浓度含量不同的复杂样品很难做到精准检测。

2、纳米孔道表面修饰的核酸探针除了增加了孔道表面的负电荷外，还提供了较大的位阻作用，这种位阻作用与电荷作用相反，可以降低离子电流。为了尽可能位阻作用的影响，横向二维通道逐渐发展其他，它主要利用二维纳米片堆叠之间的空隙进行离子传输，当在外表面修饰功能化器件时，孔道内的离子电流只受到外表面电荷的长程作用力影响，而不会受到功能化器件自身位阻的影响。其中氧化石墨烯(graphene oxide，go)膜因其独特的二维结构和可调的物理化学性质而引起了人们的极大兴趣。最近已有文献证明，但是氧化石墨烯纳米片上丰富的含氧官能团可以与水分子发生强水合，并产生额外的静电斥力对抗π-π引力，导致氧化石墨烯膜在水中膨胀甚至解体。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供了一种基于可调dna支架网络的纳米通道传感器及其制备方法与应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

3、本发明的第一目的是提供一种基于可调dna支架网络的纳米通道传感器，包括多巴胺改性的氧化石墨烯纳米通道和通过锚定链固定在所述氧化石墨烯纳米通道外表面的dna支架网络，所述dna支架网络以所述锚定链为基底由下自上组装，包括：a.多层主链结构，所述主链结构包括由两条主链dna单链通过部分碱基序列互补配对结合构成超级三明治结构的双链体，两条所述主链dna单链均具有第一支链段，分别位于5’和3’；b.相邻两层主链结构之间的支链结构，所述支链结构包括第二支链段和两条所述第一支链段，所述第二支链段与两条所述第一支链段通过碱基互补配对结合，与所述锚定链通过碱基互补配对结合的所述第二支链段为靶标dna分子，通过调控dna支架网络的组装层数，进而调控所述纳米通道膜的外表面的电荷密度逐步增加，以实现靶标dna分子的检测。

4、进一步的，所述锚定链还包括dnazyme，所述dnazyme锚定在所述纳米通道膜的外表面，所述dnazyme的底物链连接所述锚定链与第一层所述主链结构，形成dna支架网络，当有金属离子存在时，使得dnazyme的底物链断裂，dna支架网络从纳米通道外表面脱离，使电化学信号下降，以实现金属离子检测。

5、进一步的，所述锚定链还包括atp核酸适配体的互补链，所述atp核酸适配体的互补链锚定在所述纳米通道膜的外表面，使用所述atp的适配体连接所述锚定链与第一层所述主链结构，当有atp存在时，与所述atp的适配体结合，使得所述atp的适配体与所述atp核酸适配体的互补链杂交的双链解旋，dna支架网络从纳米通道外表面脱离，使电化学信号下降，以实现atp检测。

6、进一步的，所述dna支架网络的组装层数不大于五层。

7、本发明的第二目的是提供上述的纳米通道传感器的制备方法，包括以下具体步骤：

8、步骤s1，多巴胺改性氧化石墨烯的纳米通道膜的制备：

9、取片状氧化石墨烯，加入超纯水，制成片状氧化石墨烯悬浮液，超声使氧化石墨烯悬浮液混匀；向上述氧化石墨烯分散液中加入tris，随后用hcl调整分散液ph值；边搅拌加入盐酸多巴胺，常温下磁力搅拌后离心除去上清液，用超纯水洗涤，超声后进行真空抽滤，将处于水系滤膜上的氧化石墨烯膜置于烘箱干燥，得到片状堆叠结构的纳米通道膜；

10、步骤s2，单层dna支架网络的合成：

11、根据碱基互补配对原则，以靶标dna核苷酸序列为基础设计出所述锚定链的碱基序列；将构建所述主链结构的两条主链dna单链分别记为s1和s2；构建所述支链结构的支链段，记为r1-n、r2-n，其中n代表层数，所述支链结构的构建如下：

12、当n＝1时，r1-1的3’端部分碱基序列与所述锚定链互补配对结合，r1-1的5’端部分碱基序列与所述s1的第一支链段互补配对结合；

13、当n＞1时，r1-n的5’端部分碱基序列与r2-(n-1)的3’端互补配对结合，r1-n的3’端部分碱基序列与所述s1的第一支链段互补配对结合，所述r2-(n-1)的5’端部分碱基序列与所述s2的第一支链段互补配对结合；

14、具体合成过程为：取s1和s2混合在tris-hcl缓冲液中，金属浴中随后缓慢降至室温，加入已退火的r1-n和r2-n，即得每一层的单层dna支架网络；所述的金属浴的条件为95℃±0.5℃加热10～12min，所述的退火的条件为先95℃±0.5℃10～12min，然后4℃±0.5℃7～8min；

15、步骤s3，dna支架网络的装配：

16、将步骤s1制备得到的纳米通道膜使用kcl浸泡后，滴加所述锚定链，修饰20-40min后，使用kcl清洗，将步骤s2制备得到的每一层的单层dna支架网络依次滴加在修饰锚定链的纳米通道膜的外表面，杂交后用kcl清洗，依次装配完成。

17、进一步的，所述s1、s2、r1-n和r2-n的摩尔浓度比为(1.1～1.3)：(1.1～1.3)：1：1。

18、进一步的，步骤s1中，步骤s1中，所述盐酸多巴胺与所述片状氧化石墨烯的质量比为0.8:1～1.2:1。

19、进一步的，每平方厘米改性氧化石墨烯上连接有0.7-1.5μm锚定链，7-15nm单层dna支架网络。

20、本发明提供的第三目的是提供上述的纳米通道传感器用于核酸分子或离子的定性、定量分析。

21、本发明的第四目的是提供采用上述的纳米通道传感器的检测方法，将所述纳米通道传感器夹设在对称电解池之间，所述对称电解池内装有电解液kcl溶液，ag/agcl电极分别作为参比电极和工作电极，利用皮安表进行iv测试，电压设置为-1v至1v，使用杂交后的1v时的电流减去杂交前1v时的电流得到δi，用δi除以杂交前的电流得到信号比，然后以不同浓度的靶标dna的信号比绘制浓度标准曲线，将测得待测样品的信号比代入标准曲线中，计算得到待测样品中dna分子或者金属离子或者atp的浓度。

22、与现有技术比较，本发明提供的技术方案带来的有益效果是：

23、(1)本发明提供了一种基于可调dna支架网络的纳米通道传感器及其制备方法与应用。该传感器包括多巴胺改性的氧化石墨烯纳米通道和通过锚定链固定在氧化石墨烯纳米通道外表面的dna支架网络，锚定链的5’端连接腺嘌呤段，腺嘌呤段吸附在氧化石墨烯纳米通道外表面。dna支架网络使用多价核酸作为进行层层组装的基础单元，加大反应亲和力，通过在氧化石墨烯上接枝pda来调节氧化石墨烯纳米片的微观结构和纳米通道的大小的策略，获得在水中长时间的稳定性，通过精确调控组装层数，精准调控纳米通道外表面的电荷密度逐步增加，实现了对靶标dna检出限的动态调节，实现高灵敏度检测。

24、(2)本发明提供的构建dna支架网络的方法，是按照1bp，2bps，3bps，4bps，5bps的顺序逐层组装，组装结束后，使用皮安表测试iv曲线(-1v至1v),因为dna所带负电荷诱导钾离子电流增大。使用1v时组装dna支架网络前后的电流差值除以组装dna支架网络前的电流(定义为信号比)表示dna支架网络对离子电流的调制作用。随着dna支架网络组装程序的进行，电流逐渐增大，信号比也逐级增大，将dnazymes引入到dna支架网络中来，当存在dnazymes特异性识别的金属离子，dnazymes的底物链被断开，使得dna支架网络结构从纳米通道膜外表面脱落，使得电流降低，可以用于金属离子的特异性检测；将atp核酸适配体的互补链引入到dna支架网络中来，当存在atp时，使得atp的核酸适配体与其互补链杂交的双链解旋，dna支架网络从纳米通道外表面脱离，使电化学信号下降，可以用于atp的特异性检测.