将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液和方法与流程

本发明涉及一种将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液和方法，属于细胞分化。

背景技术：

1、诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，ips细胞)，是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。2006年日本京都大学shinyayamanaka在学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究，他们把oct3/4、sox2、c-myc和klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的ips细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。

2、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，msc)是一种多能干细胞，首次分离于骨髓，后来在脂肪、脐带和牙髓等部位均分离出此类成纤维样形态的细胞。msc具有成骨、成脂和成软骨分化潜力，表达cd73、cd90、cd105等标志，但不表达hla-dr，因此其具有低免疫型；另外msc分泌许多细胞因子，在再生医学和免疫调节方面具有重要作用；因此，多项ⅰ～ⅲ期临床试验使用自体或异体msc治疗退行性疾病和自身免疫性疾病如神经退行性疾病、缺血性心脏病、抗宿主移植(gvhd)疾病等。体外动物实验和体内临床试验也均表明移植的msc可以归巢至损伤或炎症部位，通过细胞间接触或旁分泌作用，促进细胞存活、损伤细胞修复或分化为功能性细胞。

3、多种成体组织来源的msc已用于临床试验，但不同来源、不同培养方法甚至不同冻存条件都对细胞质量和功能有影响。原代分离的msc一般具有有限的增殖能力，长期培养后细胞的功能和分化潜力都受到影响，如骨髓来源msc倍增时间约3.75天，可以扩增到10代左右；脂肪来源msc倍增时间约1.6天，而脐带来源msc倍增时间更短，扩增能力也更强。除此之外，脐带来源msc具有更低的免疫原性和更强的免疫调节作用，且分泌更高的il-6、il-8等细胞因子。研究发现，不仅从不同组织来源如骨髓、脂肪和脐带血分离获取的msc具有不同的生物学特性，而且从不同健康供体来源的骨髓msc也具有不同的增殖能力和成骨分化潜能，这就导致msc细胞治疗临床试验中会产生不一致的数据。另外，不同年龄的供体所获得的msc质量不同，年老供体由于细胞衰老、dna损伤积聚以及代谢不稳定等因素使得msc扩增能力、分化潜能和临床使用受限。早期研究采用将hesc和基质细胞如op9细胞共培养的方法诱导分化为msc，但此方法培养时间久且诱导分化效率低；另外拟胚体(eb)方法也被用于msc的诱导，如使用pdgf-ab和fgf2诱导分化的msc细胞可经流式分选后获得；但这些方法不仅耗时而且效率不高，难以用于临床试验。目前尚未见到关于将诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的报道。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，为克服获得间充质干细胞的方法耗时长、产量低的问题，本发明提供了一种将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液和方法。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液，由神经外胚层诱导培养液、间充质干细胞分化培养液和间充质干细胞维持培养液组成。

4、所述神经外胚层诱导培养液，由neurobasal培养基、dmem/f12培养基、n2添加剂、b27添加剂、gsk3抑制剂和tgf-β抑制剂组成，其中，各组分的用量配比关系为：neurobasal培养基占47％～50％(体积百分数，下同)，n2添加剂占0.8～1.2％，b27添加剂占1.8～2.2％，gsk3抑制剂的浓度为8～12μm，tgf-β抑制剂的浓度为2.5～3.5μm，余量为dmem/f12培养基。

5、所述间充质干细胞分化培养液，由egf(表皮细胞生长因子)、bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)和间充质干细胞维持培养液组成，其中，egf的浓度为4～6ng/ml，优选5ng/ml，bfgf的浓度为4～6ng/ml，优选5ng/ml。

6、所述间充质干细胞维持培养液为yinfengbio无血清培养基，该培养基是现有技术中已有的培养基，可常规市场购买得到，是北京银丰鼎诚生物科技有限公司自主研发的培养基，由400ml的mesenchy stem cell basal medium和100ml的mesenchy stem cellsupplement组成。

7、优选的，所述神经外胚层诱导培养液中，各组分的用量配比关系为：neurobasal培养基占48.5％，n2添加剂占1.0％，b27添加剂占2.0％，gsk3抑制剂的浓度为10μm，tgf-β抑制剂的浓度为3.0μm，余量为dmem/f12培养基。

8、所述neurobasal培养基、dmem/f12培养基为常用的细胞培养基，可常规市场购买得到；所述n2添加剂、b27添加剂为常用的神经细胞培养添加剂，可常规市场购买得到。

9、所述tgf-β抑制剂选自sb431542，可常规市场购买得到；其可诱导干细胞向多方向细胞分化，包括内皮细胞、神经细胞等，也可直接用于胚胎干细胞向间充质样细胞的分化。

10、所述gsk3抑制剂选自chir99021，可常规市场购买得到；其是一种wnt信号的激活剂，与forskolin/isx-9/sb431542等试剂联合使用时诱导神经细胞的分化。

11、所述将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的培养液在将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞中的应用。

12、一种将人诱导性多能干细胞间接诱导为间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

13、(1)取诱导性多能干细胞，在37℃、5％co2条件下，采用神经外胚层诱导培养液定向分化培养6天，得培养液；定向分化培养期间每1～3天(优选1天)更换一次培养液；

14、(2)步骤(1)所得培养液(含神经外胚层细胞)，在37℃、5％co2条件下，采用间充质干细胞分化培养液分化培养7天，得培养液；定向分化培养期间每1～3天(优选1天)更换一次培养液；在间充质干细胞分化培养液的诱导下，神经外胚层细胞向间充质干细胞转变，生长因子可促进细胞的转变和快速生长，并维持细胞在生长过程中的良好状态；

15、(3)步骤(2)所得培养液，在37℃、5％co2条件下，采用间充质干细胞维持培养液培养3～5代，得间充质干细胞；培养期间每2～4天(优选2天)更换一次培养液。

16、本发明的培养液，采用neurobasal和dmem/f12基础培养基，并添加有维持细胞生长必须的关键成分n2和b27等，以及gsk3抑制剂、tgf-β抑制剂、egf等因子，各组分定向起作用，可协同诱导ipscs细胞定向分化为间充质干细胞。培养液中含有特定的信号抑制剂，可以提高间充质干细胞的纯度和产量。

17、本发明的方法，可在较短时间内将诱导性多能干细胞定向分化为间充质干细胞。本发明以诱导性多能干细胞为起始，原材料数量不受限制，诱导性多能干细胞可以无限扩增，且避免了胚胎干细胞使用方面的道德争议。培养周期为2周左右，大大缩短了培养时间，降低了生产成本。本发明培养间充质干细胞使用的是无血清培养液，得到的间充质干细胞可快速向临床转化。