一种微氧或厌氧条件下产麦角硫因的重组基因工程菌及其制备方法和用途与流程

本发明属于基因重组发酵，具体涉及一种微氧或厌氧条件下产麦角硫因的重组基因工程菌及其制备方法和用途。

背景技术：

1、麦角硫因，是一种稀有的天然手性氨基酸衍生物。在溶解的状态下，麦角硫因以其硫酮和硫醇两种结构之间的互变异构体的形式存在；而在生理ph值下，麦角硫因主要以硫酮的形式存在。其具清除自由基、解毒、维持dna的生物合成、细胞的正常生长、细胞免疫、抗辐射、美白及抗衰老等独特的细胞生理保护功能；并且麦角硫因光热稳定性好，不易被氧化分解，是一种水溶性化妆品原料，易于配伍以及其在表皮细胞中无毒性，所以在使用的时候皮肤不会产生刺激，故广泛应用于化妆品行业。此外麦角硫因在食品、功能食品和生物医药等行业也有广阔的应用前景。2014年，麦角硫因就被国家食品药品监督管理局列入已使用化妆品原料目录以及2018年被列入欧盟新资源食品清单。

2、目前麦角硫因的来源主要有三种：化学合成法、生物合成法以及动植物提取法。用化学合成左旋的麦角硫因十分困难，合成的原料昂贵，合成成本高，麦角硫因产品必须达到很高的纯度才能保证产品的安全；提取法因原料中麦角硫因的含量低，提取成本高且杂质多；而通过在常用改造工程菌株中异源表达麦角硫因合成途径，并通过代谢途径改造来获得高效合成麦角硫因的工程菌，极具发展前景。

3、现有文献报道中，利用基因工程菌生产麦角硫因主要通过有氧发酵，例如，王丽等，产麦角硫因大肠杆菌工程菌株的构建与优化[j],生物工程学报，2022,38(2)：796-805，其就通过基因工程菌的有氧发酵提高了麦角硫因的产率，但有氧发酵能耗高，在大生产条件下，微氧或厌氧发酵能节省大量的能源和动力用于无菌空气制备，但目前对厌氧发酵研究甚少主要集中在酶催化，有必要开发一种能耗成本低，产率高的基于基因工程菌，在微氧或厌氧条件下生产麦角硫因的方法。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种产麦角硫因的重组基因工程菌，它是重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌包含如下基因：

2、l-组氨酸n-甲基转移酶eana基因，硫代硫酸硫转移酶eanb基因，半胱氨酸脱硫酶iscs基因，胱硫醚γ裂解酶cys3基因和胱硫醚β合成酶cys4基因。

3、进一步地，所述l-组氨酸n-甲基转移酶eana基因来自鲁伯盐碱杆菌，其核苷酸序列为ncbi reference sequence:wp_011404736.1所示；

4、所述硫代硫酸硫转移酶eanb基因来自褐杆状绿菌，其核苷酸序列为genbank:mbl6957067.1登录号所示；

5、所述半胱氨酸脱硫酶iscs基因来自大肠杆菌，其核苷酸序列为genbank:eej46382.1所示；

6、所述胱硫醚γ裂解酶cys3基因来自酿酒酵母，其核苷酸序列为genbank:cp046081.1所示；

7、所述胱硫醚β合成酶cys4基因来自酿酒酵母，其核苷酸序列为genbank:cp046087.1所示。

8、进一步地，所述重组大肠杆菌不含环丙烷脂肪酰基磷脂合成酶cfa基因、丝氨酸o-乙酰转移酶cyse基因，缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶avta基因，谷氨酸-丙酮酸转氨酶yfbq基因，丙氨酸合成转氨酶yfdz基因和/或丙酮酸激酶pyka基因。

9、更进一步地，所述环丙烷脂肪酰基磷脂合成酶cfa基因的核苷酸序列为ncbireference sequence:np_416178.1所示；

10、所述丝氨酸o-乙酰转移酶cyse基因的核苷酸序列为ncbi reference sequence:np_418064.1所示；

11、所述缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶avta基因的核苷酸序列为ncbi referencesequence:yp_026231.1所示；

12、所述谷氨酸-丙酮酸转氨酶yfbq基因的核苷酸序列为ncbi reference sequence:np_416793.1所示；

13、所述丙氨酸合成转氨酶yfdz基因的核苷酸序列为ncbi reference sequence:np_416880.1所示；

14、所述丙酮酸激酶pyka基因的核苷酸序列为ncbi reference sequence:np_416368.1所示。

15、进一步地，所述大肠杆菌为大肠杆菌e.coli w3110。

16、本发明还提供了一种前述重组基因工程菌的制备方法，它包括如下步骤：

17、1)取l-组氨酸n-甲基转移酶eana基因和胱硫醚γ裂解酶cys3基因融合，融合产物与线性化表达载体连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体a；

18、2)取带有plac启动子的硫代硫酸硫转移酶eanb基因、半胱氨酸脱硫酶iscs基因和胱硫醚β合成酶cys4基因融合，融合产物与线性化后的步骤1)所得重组表达载体a连接，再导入大肠杆菌，提取重组表达载体b；

19、3)将步骤2)所得重组表达载体b导入敲除了环丙烷脂肪酰基磷脂合成酶cfa基因、丝氨酸o-乙酰转移酶cyse基因、缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶avta基因、谷氨酸-丙酮酸转氨酶yfbq基因、丙氨酸合成转氨酶yfdz基因和丙酮酸激酶pyka基因的大肠杆菌，即得。

20、进一步地，步骤1)所述表达载体为质粒ptrc99a；步骤2)所述plac启动子的核苷酸序列如seq id no.64所示；步骤3)所述大肠杆菌为大肠杆菌e.coli w3110。

21、本发明最后提供了一种麦角硫因的生产方法，它包括如下步骤：

22、a、取前述的重组基因工程菌，接种于lb种子培养基培养，得到种子液；

23、b、取步骤a所得种子液，接种于m9发酵培养基发酵，取发酵液离心，即得。

24、进一步地，所述lb种子培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠10g/l、氨苄青霉素100mg/l，余量为水；

25、所述m9发酵培养基的配方为glucose 10g/l、kh2po4 3g/l、na2hpo46.78g/l、nacl0.5g/l、nh4cl 1g/l、mgso4 0.241g/l、cacl2 0.011g/l、edta0.05g/l、fecl3·6h2o0.0083g/l、zncl2 0.0084g/l、cucl2·2h2o 0.00013g/l、cocl2·6h2o 0.001g/l、h3bo30.0001g/l、mncl3·6h2o 0.000016g/l、na2moo4·h2o 0.0003g/l、met 4g/l、his 4g/l、iptg0.1mm、氨苄青霉素100mg/l，余量为去离子水；所述m9发酵培养基的ph值7.0。

26、进一步地，步骤a所述培养的条件为：30℃、200rpm条件下培养；

27、和/或，步骤b所述发酵的条件为：厌氧或微氧；优选的，以0.5～2.5ml/min速度注入co2 1～5min，密封后在20～40℃条件下静止培养40～60h。

28、本发明产麦角硫因的重组基因工程菌，通过在大肠杆菌中导入l-组氨酸n-甲基转移酶eana基因，硫代硫酸硫转移酶eanb基因，半胱氨酸脱硫酶iscs基因，胱硫醚γ裂解酶cys基因3和胱硫醚β合成酶cys4基因，并进一步敲除大肠杆菌基因组上的环丙烷脂肪酰基磷脂合成酶cfa基因、丝氨酸o-乙酰转移酶cyse基因、缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶avta基因、谷氨酸-丙酮酸转氨酶yfbq基因、丙氨酸合成转氨酶yfdz基因和丙酮酸激酶pyka基因，使其在厌氧条件下摇瓶发酵生产产量达到350mg/l，减少能耗，降低成本同时保证了产麦角硫因的产量，适宜实际推广应用。

29、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

30、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。