一类富含D型色氨酸和D型赖氨酸具有不同β-转角的β-发卡抗菌短肽及其应用

本发明属于生物化学，涉及一类富含d型色氨酸和d型赖氨酸的β-发卡抗菌短肽，本发明同时还涉及该抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用。

背景技术：

1、随着“后抗生素”时代的逼近，世界卫生组织指出，抗生素和其他抗菌药物的疗效下降正在成为一个全球性问题(reardon,2014)。曾经抗生素的优异疗效挽救了无数生命，但是抗生素的误用和滥用导致了耐药菌的富集，导致很多耐药菌感染患者到最后无药可用。因此迫切需要开发新型抗生素替代品来对抗超级耐药菌。

2、抗菌肽具有多种作用机制，其中最主要的是破坏细菌膜的完整性来发挥抗菌作用。细菌膜结构具有不易发生变异的特点，因此抗菌肽不容易产生耐药性。但是天然抗菌肽通常序列很长、选择性差且稳定性差，因此合成产率低、成本高，难以在保持低毒性的同时具有高效的抗菌活性，且容易被酶降解而失效。

3、α-螺旋和β-折叠是合成抗菌肽中常见的两个主要二级结构。α-螺旋很难在高活性和低毒性之间达到完美的平衡，使其选择性较低。而β-发夹结构由两条平行链和一个β-转角组成，在细菌膜的条件下，疏水氨基酸或带正电荷的残基排列在片层的两侧，以形成类似于α-螺旋的两亲性结构使其具有高抗菌活性，较多的正电荷氨基酸使其在细菌和正常细胞之间的选择性增加，因此，相比于α-螺旋抗菌肽，β-发夹结构抗菌肽具有更好的应用价值。而现有的β-发夹结构抗菌肽大多具有较长的肽链，合成成本高昂。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一类富含d型色氨酸和d型赖氨酸的β-发卡抗菌短肽。

2、本发明的目的之二是提供上述抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用。

3、为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、一、富含d型色氨酸和d型赖氨酸具有不同β-转角的β-发卡抗菌短肽的结构设计

5、本发明富含d型色氨酸和d型赖氨酸的β-发卡抗菌短肽是以β-发卡为结构基础，以不同的β-转角为中心，三个d型色氨酸和两个d型赖氨酸分别交替排列在两侧，然后在c末端进行酰胺化所得，其结构通式为：

6、dwdkdwdkdwzzdwdkdwdkdw-nh2，其中zz＝dpg，pg，dpp，ng，gg。

7、更具体地，所述抗菌短肽为：

8、dwdkdwdkdw dpg dwdkdwdkdw-nh2，标记为w-1，其氨基酸序列为d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-d-pro-gly-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-nh2；

9、或：dwdkdwdkdwpg dwdkdwdkdw-nh2，标记为w-2，其氨基酸序列为d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-pro-gly-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-nh2；

10、或：dwdkdwdkdwdpp dwdkdwdkdw-nh2，标记为w-3，其氨基酸序列d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-d-pro-pro-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-nh2；

11、或：dwdkdwdkdwng dwdkdwdkdw-nh2，标记为w-4，其氨基酸序列为d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-asn-gly-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-nh2；

12、或：dwdkdwdkdwgg dwdkdwdkdw-nh2，标记为w-5，其氨基酸序列为d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-gly-gly-d-trp-d-lys-d-trp-d-lys-d-trp-nh2。

13、优选地，所述抗菌短肽为dwdkdwdkdwng dwdkdwdkdw-nh2，标记为w-4。

14、上述富含d型色氨酸和d型赖氨酸具有不同β-转角的β-发卡抗菌短肽均采用经典固相合成法制备得到。

15、二、富含d型色氨酸和d型赖氨酸具有不同β-转角的β-发卡抗菌短肽在制备临床抗菌药物中的应用

16、1、体外抑菌实验

17、采用微量肉汤稀释法测试抗菌短肽的最低抑菌浓度。二倍稀释法用mh肉汤配制2～256μm的抗菌短肽溶液。取50μl加入无菌96孔板中，培养至对数时期的菌液稀释为1×105cfu/ml后加50μl到96孔板中抗菌短肽溶液中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌短肽)和阴性对照(既不含菌液也不含抗菌短肽)。在孵育箱中37℃恒温孵育18h，肉眼观察最低能够使实验孔澄清透明的肽浓度即为该肽对该种细菌的最低肽浓度。实验以多粘菌素b、万古霉素和杆菌肽为阳性对照，测试进行3次独立重复，每次重复三个平行。检测结果见表1。

18、表1本发明抗菌短肽对常见标准菌株的最低抑菌浓度(μm)

19、

20、表1结果显示，本发明抗菌短肽对以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌，以及对以肺炎克雷伯杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌为代表的革兰氏阴性菌都有很强的抑制作用，表现为广谱抗菌活性。

21、2、溶血活性试验

22、为了考察本发明合成的抗菌短肽对正常哺乳动物细胞的毒性，对本发明抗菌短肽与小鼠红细胞(8％v/v)孵育1h后的溶血情况进行测定，结果见图1。

23、图1结果显示，本发明的抗菌短肽w-3和w-4的溶血活性较低，尤其是w-4在512μm的溶血活性依然低于10％，而512μm远高于所测其对六种细菌的最低抑菌浓度。该结果说明本发明的优选肽w-4合成的抗菌短肽毒性低，用药安全。

24、3、酶解稳定性试验

25、为了考察本发明合成的抗菌短肽对酶的敏感性，我们将抗菌短肽与不同浓度的胰蛋白酶和糜蛋白酶共孵育1h后在60℃孵育15min将酶灭活，再将酶处理过后的抗菌短肽(2×mic)与金黄色葡萄球菌(1×105cfu/ml)等体积共孵育18h，检测抗菌短肽抑菌活性的变化，结果见图2。

26、图2结果显示本发明的抗菌短肽与2000μg/ml的糜蛋白酶或胰蛋白酶孵育1h后仍可以完全抑制金黄色葡萄球菌的生长，说明本发明的抗菌短肽具有很强的酶抵抗性，可以用于口服药物的设计。

27、本发明的有益效果在于：

28、1、本发明以不同类型的β-转角为对称中心，三个d型色氨酸和两个d型赖氨酸分别交替排列在两侧得到中心对称的β-发卡型抗菌短肽w-1至w-5，其具有高抗菌活性和很强的酶解稳定性，尤其是w-4，具有极低的溶血毒性，在制备临床抗菌药物中具有很好的应用前景。具体地，本发明抗菌短肽由于富含d型氨基酸从而具有高稳定性；大量疏水性d型色氨酸的应用使其能够发挥强大的抗菌效果；阳离子氨基酸(d型赖氨酸)的应用有利于提高抗菌短肽在正常哺乳动物细胞膜和带负电荷的细菌膜之间的选择性。疏水氨基酸和阳离子氨基酸交替排列以及β-转角的应用有利于其保持低毒性。

29、2、本发明提供的抗菌短肽序列短，且肽链呈中心对称结构，合成成本低廉。