一种天然二聚儿茶素色素及其制备方法和应用

本发明涉及天然产物化学合成和分离纯化，具体涉及一种天然二聚儿茶素色素及其制备方法和应用。

背景技术：

1、儿茶素是茶叶中主要的多酚类物质，并且具有明显的苦味和涩味，是形成茶汤综合口感的主要物质之一。此外，儿茶素具有较强的生物活性，是茶叶中主要的健康活性物质。而热加工处理(高温干燥或烘焙)是茶叶生产过程中非常重要的步骤，不仅能降低茶叶中的水分，还能显著改善茶叶的风味。茶叶经过高温烘焙后茶汤颜色加深，干茶色泽呈棕黄色甚至黑褐色。这除了与美拉德反应、焦糖化反应有关外，还可能是由于多酚发生非酶促氧化反应，形成结构更加稳定的聚合色素，进而促进茶汤综合色泽的形成，这类天然色素更适合于食品中的开发应用。

2、近年来，利用体外模型或者茶叶真实基质研究儿茶素的转化产物结果表明。在热反应过程中，儿茶素主要发生异构化、降解反应和聚合反应。目前主要关于ec、egc、egcg或者其他儿茶素在水溶液或者固体粉末的体外模型中的转化产物研究，但是研究模型的温度低于90℃。2003年，jack m.miller课题组利用儿茶素ec和c在常温水溶液(ph 6.5)条件下研究儿茶素的转化产物，并利用lc-ms鉴定了一些儿茶素的脱氢二聚体(weixing sun andjack m.miller.tandem mass spectrometry of the b-type procyanidins in wine andb-type dehydrodicatechins in an autoxidation mixture of(+)-catechin and(-)-epicatechin[j].journal of mass spectrometry，2003.)。2008年，chang-qing duan课题组利用儿茶素ec和c在常温水溶液(ph 6)条件下反应24h研究儿茶素的转化产物，并利用lc-ms鉴定了一些儿茶素的脱氢二聚体(fei he.,qiu-hong pan.，ying shi.，etal.identification ofautoxidation oligomers offlavan-3-ols in model solutionsby hplc-ms/ms[j].journal ofmass spectrometry，2008.)。2012年，lisa j.mauer课题组利用egcg在85℃的体外水溶液模型或者固体模型条件下研究其结构稳定性和颜色变化，发现随着时间的延长，颜色逐渐加深，并利用lc-ms鉴定了两个主要的egcg二聚体(聚酯型儿茶素a和d)(na li.,lynne s.taylor.,mario g.ferruzzi.,et al.color and chemicalstability oftea polyphenol(-)-epigallocatechin-3-gallate in solution andsolid states[j].food research international，2012.)。2016年，梁月荣课题组利用8种儿茶素(ec、c、egc、gc、ecg、cg、egcg和gcg)在90℃的体外水溶液模型中分别研究了儿茶素的转化产物，并通过利用lc-ms鉴定了一些儿茶素的二聚体或异构化和降解产物(fang-yuan fan.,meng shi.,ying nie.,et al.differential behaviors of tea catechinsunder thermal processing:formation of non-enzymatic oligomers[j].foodchemistry，2016.)。

3、2019年，thomas hofmann课题组利用儿茶素ec或c在体外碱性溶液及90℃加热条件下研究了儿茶素转化产物，并通过分离和纯化鉴定了一些儿茶素二聚体化合物(danielgermann,timo d.stark,and thomas hofmann.formation and characterization ofpolyphenol-derived red chromophores:enhancing the color ofprocessed cocoapowders:part1[j].journal ofagricultural and food chemistry，2019.)。2020年，jean-paul vincken课题组利用ec和egc水溶液模型在80℃下研究了不同反应时间下的主要产物和溶液颜色变化，并通过lc-ms鉴定了一些儿茶素二聚体或者三聚体(junfengtan.,wouter j.c.de bruijn.,annemiek van zadelhoff.,et al.browning ofepicatechin(ec)and epigallocatechin(egc)by auto-oxidation[j].journalofagricultural and food chemistry,2020.)。

4、研究人员相继利用儿茶素在体外加热条件下研究其结构稳定性、转化产物和颜色变化。但是主要通过lc-ms对主要聚合产物进行鉴定，反应温度较低，产生呈色物质的时间较长，含量较低，没有建立高效的合成和分离纯化方法；以及没有通过分离纯化和鉴定关键的呈色物质结构，并研究其颜色特性。导致对儿茶素高温加热后的聚合色素分离难度困难，极大限制了该类天然聚合色素在茶饮料、新式茶饮的调色和食品着色领域的开发应用。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提供了一种天然二聚儿茶素色素及其制备方法和应用，本发明采用体外合成、分离纯化和鉴定得到天然二聚儿茶素色素，具有促进茶汤红、黄色泽的形成，推进了天然二聚儿茶素色素在茶饮料、新式茶饮的调色和食品着色领域的开发应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种天然二聚儿茶素色素的制备方法，包括以下步骤：

4、步骤1，粗反应产物制备：将表型儿茶素、ph调节剂和水混合，在敞开和加热条件下进行非酶促氧化反应，得到含有二聚儿茶素色素的粗反应产物；

5、步骤2，萃取、浓缩和粗分离：向粗反应产物中加水复溶，再用乙酸乙酯进行萃取，并除去水相，得到乙酸乙酯萃取相，并进行蒸发浓缩，得到浓缩干燥的乙酸乙酯萃取相；

6、步骤3，ods-c18反向层析柱分离：将浓缩干燥后的乙酸乙酯萃取相用10％甲醇水(v/v，水含0.2％甲酸)复溶，将复溶后的甲醇水溶液经过ods-c18反向层析柱进行分离，采样不同浓度的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，得到富含六种二聚儿茶素色素或者单体二聚儿茶素色素粗品；

7、步骤4，中低压制备柱分离：将富含六种二聚儿茶素色素或者单体二聚儿茶素色素粗品利用中低压制备柱进行分离，以含0.2％甲酸的甲醇水溶液(v/v，水含0.2％甲酸)进行梯度洗脱，根据紫外吸收信号峰位置并收集含有二聚儿茶素色素的洗脱液，将收集的洗脱液经减压干燥，得到纯度大于80％六种化合物，其结构分别如式i(egcg)、式ⅱ(egc)、式ⅲ(ec)、式ⅳ(ecg)、式ⅴ(egc-ecg)和ⅵ(egcg-ec)所示，并对其进行检测；

8、

9、进一步地，步骤1所述反应底物表型儿茶素选自egcg、ecg、egc、ec中任意一种或四种的混合物。

10、进一步地，步骤1所述水的质量为表型儿茶素质量的50～1000000％。

11、进一步地，步骤1所述ph调节剂为酸或碱，所述非酶促氧化反应的ph值为3～12。

12、进一步地，步骤1所述加热温度为20～200℃，所述非酶促氧化反应时间为10～180min。

13、进一步地，步骤3所述分离所用填料为ods-c18颗粒，该ods-c18颗粒为粒径范围为5～200μm。

14、进一步地，步骤3所述梯度洗脱包括：

15、洗脱梯度1所用洗脱剂为0.2％的甲酸水(v/v，水含0.2％甲酸)和甲醇，0.2％甲酸水混合液和甲醇的体积比为90:10；

16、洗脱梯度2所用洗脱剂为0.2％的甲酸水(v/v，水含0.2％甲酸)和甲醇，0.2％甲酸水混合液和甲醇的体积比为75:25；

17、洗脱梯度3所用洗脱剂为0.2％的甲酸水(v/v，水含0.2％甲酸)和甲醇，0.2％甲酸水混合液和甲醇的体积比为50:50；

18、洗脱梯度4所用洗脱剂为纯甲醇。

19、进一步地，步骤4所述中低压制备柱分离所用填料为ods-c18颗粒，粒径范围为5～100μm；采用梯度洗脱，洗脱剂为5％～80％甲醇水溶液(v/v，水含0.2％甲酸)。

20、进一步地，步骤4所述检测方法中所用色谱柱为c18反向色谱柱，流动相包括a相和b相，其中：a相为体积浓度0.1％的甲酸水溶液(v/v，水含0.2％甲酸)，b相为乙腈；流速为0.15～1ml/min，柱温为25～40℃，检测波长为278nm，进样量为1～50μl，洗脱时间为0～25min。

21、本发明还公开了一种根据任一上述制备方法制得的天然二聚儿茶素色素。

22、本发明还公开了一种根据上述天然二聚儿茶素色素在茶饮料生产中的应用。

23、进一步地，该应用包括：

24、将二聚儿茶素色素添加至茶饮料中，添加量为20mg/l～1g/l。

25、本发明的有益效果在于：

26、(1)本发明成本低廉、产品纯度高

27、萃取使用的溶剂，ods-c18反向层析柱、反相色谱柱分离所使用的溶剂均可以回收利用；反相层析分离使用的材料均可以重复利用，回收利用的溶剂和重复利用的分离材料保证了较低廉的分离平均成本。

28、(2)本发明的制备方法可实现规模化生产需要

29、原料要求不高、成本低廉，一般购买的分析纯儿茶素均可，易于批量备料；浓缩、萃取操作简单；分离采用ods-c18反向层析柱粗分，该ods-c18反向层析柱填料可以装于中压柱层析系统中，可反复利用，分离量大，易于实现规模化生产；粗分后采用反相色谱柱进一步分离，也非常适宜规模生产。