一株产己二酸的重组大肠杆菌的构建及其应用

本发明涉及一株产己二酸的重组大肠杆菌的构建及其应用，属于生物。

背景技术：

1、己二酸别名肥酸，是一种重要的有机二元酸。白色结晶体，结构式为hooc(ch2)4cooh。能够发生成盐反应、酯化反应、酰胺化反应等，特别是能与二元胺或二元醇缩聚形成高分子聚合物。

2、己二酸最重要的应用价值主要体现在其可作为尼龙6,6的关键前体。例如，尼龙6,6纤维和树脂的生产是由己二酸与乙二胺缩合反应而成；聚氨酯类树脂和发泡塑料的化学生产需要己二酸作为前体与多元醇缩合而成。此外，己二酸也可作为化工原料和中间体，用于杀虫剂、粘合剂、增塑剂、润滑剂、合成革、合成染料、香料以及食品添加剂等的生产。

3、利用化学合成法是当前工业生产己二酸的主要方法。美国杜邦公司首创化学生产己二酸的方法，又在原有生产工艺的基础上进一步改进，逐步用环己烷氧化法取代原有生产方法进行己二酸的大规模生产。化学合成法合成己二酸的反应条件为高温加压以及强酸强碱，反应过程较为恶劣。同时，生产原料和中间产物不够安全环保，对人体有明显的危害。生产过程中的一氧化氮和二氧化氮等气体会造成严重的环境污染。在日益重视环境保护的时代背景下，利用苯或环己烷等传统化工原料生产己二酸已经不能完全满足时代发展对环保经济的需要。因此，探索一种己二酸的绿色生产方法具有重要的研究意义。

4、通过化学加氢方法，顺,顺-粘康酸很容易转化为己二酸。利用生物酶催化法也有报道，但是酶催化活性很低，仅能催化0.7mmol/l顺,顺-粘康酸底物。在现有的研究中，研究人员已经初步尝试将生物法和化学合成法相结合生产己二酸，其具体步骤分为两步：第一步，利用微生物发酵法生产顺,顺-粘康酸；第二步，通过化学合成法转化为己二酸。然而，这些化学催化往往伴随着环境污染、转化率不高等问题。因此，现有技术当中己二酸的生产还有很大的改进空间。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明通过代谢工程手段构建了一株高产己二酸的基因工程菌，以大肠杆菌为出发菌，通过rbs序列调控己二酸生产的靶点基因片段的表达强度，优化了基因表达强度，提高了己二酸发酵生产的产量。

2、本发明的第一个目的是提供一种产己二酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌敲除了3-脱氢莽草酸脱氢酶基因aroe、负调控转录抑制因子tyrr、乙酸激酶基因acka、丙酮酸脱氢酶基因poxb和奎尼酸脱氢酶基因ydib，过表达了dhq合酶基因arob、3-脱氢奎尼酸脱水酶基因arod、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因arogfbr、磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsa、转酮醇酶基因tkta、转醛缩酶基因tala、烯酸还原酶基因gsqor和葡萄糖脱氢酶基因gdh，且所述烯酸还原酶基因gsqor和葡萄糖脱氢酶基因gdh由含有seq id no.7-9所示的rbs序列调控表达。

3、进一步地，所述重组大肠杆菌还过表达了3-脱氢莽草酸脱水酶基因aroz、原儿茶酸脱羧酶基因aroy和儿茶酚1,2-双加氧酶基因cata。

4、进一步地，所述3-脱氢莽草酸脱水酶基因aroz的核苷酸序列如seq id no.1所示，原儿茶酸脱羧酶基因aroy的核苷酸序列如seq id no.2所示，儿茶酚1,2-双加氧酶基因cata的核苷酸序列如seq id no.3所示，烯酸还原酶基因gsqor的核苷酸序列如seq idno.4所示(来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌)，葡萄糖脱氢酶基因gdh的核苷酸序列如seq idno.5所示，磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsa的ncbi编号为np_416217.1，转酮醇酶基因tkta的ncbi编号为yp_026188.1，转醛醇酶基因tala的ncbi编号为np_414549.1，dhq合酶基因arob的ncbi编号为np_417848.1，3-脱氢奎尼酸脱水酶的基因arod的ncbi编号为np_416208.1，3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因arogfbr的核苷酸序列如seq idno.6所示。

5、进一步地，3-脱氢莽草酸脱氢酶基因aroe的ncbi编号为np_417740.1，负调控转录抑制因子基因tyrr的ncbi编号为np_415839.1，乙酸激酶基因acka的ncbi编号为np_416799.1，丙酮酸脱氢酶基因poxb的ncbi编号为np_415392.1，奎尼酸脱氢酶基因ydib的ncbi编号为np_416207.1。

6、进一步地，以e.coli mg1655为出发菌株。

7、进一步地，基因gsqor和基因gdh以petac为表达载体。

8、进一步地，基因aroz、基因aroy和基因cata以pcdfduet为表达载体。

9、本发明的第二个目的是提供上述重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：

10、s1、敲除3-脱氢莽草酸脱氢酶基因aroe，敲除负调控转录抑制因子tyrr并在该位点过表达dhq合酶arob和3-脱氢奎尼酸脱水酶arod，敲除乙酸激酶基因acka并在该位点过表达3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因arogfbr，敲除丙酮酸脱氢酶基因poxb并在该位点过表达3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因arogfbr和磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsa，敲除奎尼酸脱氢酶基因ydib并在该位点过表达转酮醇酶基因tkta和转醛缩酶基因tala，构建得到出发菌株；

11、s2、将gsqor基因片段、gdh基因片段和rbs基因片段连接插入到质粒pcdfduet中，得到重组质粒pcdfduet-rbs-gsqor-gdh；

12、s3、将重组质粒pcdfduet-rbs-gsqor-gdh转化入s1构建的出发菌株中构建得到所述重组大肠杆菌。

13、进一步地，还包括以下步骤：

14、(1)将aroz基因片段、aroy基因片段和cata基因片段连接插入到质粒petac中，得到重组质粒petac-aroz-aroy-cata；

15、(2)将重组质粒petac-aroz-aroy-cata转化入宿主菌中。

16、进一步地，在步骤s2中，以rbs序列为同源臂融合基因片段。

17、本发明的第三个目的是提供上述重组大肠杆菌在制备生物、制药、食品或化工领域含己二酸或其衍生物的产品中的应用。

18、本发明的第四个目的是提供一种生产己二酸的方法，包括以下步骤：采用上述重组大肠杆菌进行发酵生产。

19、进一步地，当重组大肠杆菌中未导入基因aroz、aroy和cata时，以粘康酸为底物进行发酵生产。

20、进一步地，当重组大肠杆菌中导入基因aroz、aroy和cata时，以葡萄糖为底物进行发酵生产。

21、进一步地，所述发酵的条件为35-38℃，200-220rpm，菌株发酵初始od600为0.8-1.0。

22、进一步地，所述发酵的条件为35-38℃，650-700rpm，10-15％接种量，装液量为30-50％，ph为7.0-7.5，菌株发酵初始od600为0.8-1.0，通气量为2-3vvm。

23、进一步地，发酵培养基包括以下组分：葡萄糖10-50g/l、胰蛋白胨10-30g/l、酵母粉3-10g/l、mgso4·7h2o 5-15g/l、磷酸二氢钾0.5-3g/l、磷酸氢二钾0.1-2g/l、氯化钠0.5-5g/l。

24、本发明的有益效果：

25、本发明构建的重组大肠杆菌表达烯酸还原酶编码基因gsqor和葡萄糖脱氢酶编码基因gdh，并通过rbs筛选优化了基因的表达强度，从而提高以粘康酸为底物的己二酸生产的产量。在此基础上同时表达调控顺,顺-粘康酸的靶点基因和调控己二酸生产的靶点基因，能够实现以葡萄糖为底物从头合成己二酸，使构建的重组菌经发酵48h后，己二酸产量能达到5.3g/l。本发明采用的发酵工艺简单，易于控制，生产成本低，有利于工业化生产。