一种具有降血尿酸、抗炎作用的副干酪乳酪杆菌A21151及其应用的制作方法

本发明涉及微生物，特别涉及一种具有降血尿酸、抗炎作用的副干酪乳酪杆菌a21151及其应用。

背景技术：

1、高尿酸血症(hua)是以人体血清尿酸含量显著高于正常值为特征的的代谢性疾病。目前，大多数研究将高尿酸血症定义为非同日正常饮食状态下，两次测得男性空腹血尿酸>420μmol/l，女性空腹血尿酸>360μmol/l。高尿酸血症的发病趋势具有年轻化、高流行、男性高于女性、沿海地区发生率高于内陆地区的特点，发病率从过去的5％激增到23％。长期高血尿酸可使尿酸盐结晶沉积在关节滑膜、滑囊、软骨及其他组织中，引起急性、慢性、反复发作性炎性疾病(即痛风)。此外，高尿酸血症与炎症、肾脏疾病、心血管疾病、胰岛素抵抗等疾病的发生密切相关，常与心血管系统疾病、慢性肾脏病及代谢综合征等疾病合并出现，成为继“高血压、高血糖、高血脂”之后第4个心血管疾病的重要危险因素，随着患病率的攀升逐渐发展成为威胁人类健康的代谢疾病。

2、目前，治疗高尿酸血症及痛风的主要方法是药物治疗和控制饮食。药物治疗主要策略有两种，一是抑制尿酸生成，如黄嘌呤氧化酶的抑制剂别嘌呤醇，非布司他等；二是增加尿酸的排泄，作用于尿酸转运蛋白等，如丙磺舒，苯溴马隆等。然而长期药物治疗伴随着诸多副作用，如肝肾损害、胃肠道症状、肌肉与神经病变等。基于降尿酸药物的副作用，是否对无症状高尿酸血症降尿酸进行治疗仍存在争议，然而高水平血尿酸对机体健康的负面影响使寻求非药物途径控制尿酸水平成为必然要求。通过限制嘌呤摄入的饮食方式来防治高尿酸血症与痛风，在医学界已达成广泛共识。然而，在生活中精确限制嘌呤摄入非常困难，各种食物中嘌呤类物质含量不精确、低嘌呤食物适口性差、饮食中呈味成分主要为嘌呤前体类成分(核苷酸，核苷等)，特别是海鲜、动物的肉的嘌呤含量都比较高。严格限制嘌呤摄入的饮食方式，存在营养不均衡、严重影响病人的生活质量等问题。

3、由于尿酸的代谢与肠道息息相关，通过肠道益生菌摄取、降解消化道中的嘌呤类物质，有望成为达到控制血尿酸水平、预防及治疗高尿酸血症及痛风、控制无症状高尿酸血症的一种新策略。特别是益生菌无毒、无害无副作用的食品特点，在防治疾病方面展现出宽阔的应用前景和市场潜力。乳酸菌是一种安全的食品级微生物，在预防与治疗代谢调控类疾病中发挥着重要作用。近年发现了一些降嘌呤核苷、降血尿酸的乳酸菌菌株：明治株式会社的一株格氏乳杆菌0ll2922，1×109cfu/ml的菌悬液对1.25mm的鸟苷和1.25mm的肌苷的降解率分别为90％及70％。大连医科大学报道了一株可降高尿酸血症模型小鼠血尿酸的短乳杆菌dm9218，可以降解1.26mm肌苷和1.26mm鸟苷。吉林省农业科学院农产品加工研究所机构报道了一株植物乳杆菌ua149对1.25mm肌苷、鸟苷降解率约为60％，丰华生物科技股份有限公司发现的罗伊氏乳杆菌tsr332及发酵乳杆菌tsf331，可以降解1.26mm肌苷和鸟苷，王成华等发现的发酵乳杆菌lactobacillus fermentum 9-4对1mm肌苷、鸟苷降解率约为60％。此外，朱珺等人发现的发酵乳杆菌，对1mm的鸟苷降解率为63.06％。这些具有体外降解核苷的菌株，在对高尿酸血症模型小鼠的干预中，也表现出了降低血尿酸的作用。此外，高血尿酸通常伴随着高炎性因子，胞内尿酸水平过高可诱导白细胞信号通路重组及表观遗传修饰，从而引起对炎症信号的持续超敏反应，且可溶性尿酸与尿酸盐晶体可分别通过依赖或不依赖炎症小体的尿酸盐晶体机制及可溶性尿酸机制介导发挥潜在促炎作用，而高水平的肾脏炎性因子损坏肾脏功能，反过来又影响尿酸的排泄。因此开发出具有抗炎作用的降血尿酸乳杆菌菌株，对于防治高尿酸血症和痛风这种急性、慢性、反复发作性炎性疾病具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了具有降血尿酸、抗炎作用的副干酪乳酪杆菌a21151及其应用。本发明中的副干酪乳酪杆菌a21151分离自广西百岁老人粪便样本，并发现该菌株具有核苷降解、抗炎、抑菌以及调节肠道高尿酸血症模型小鼠肠道菌群能力，且能够有效降低尿酸，可以用于治疗高尿酸血症，具有极高的开发价值和实用价值，为相关产品的开发与应用提供了新思路。

2、本发明的第一个方面，提供了一株副干酪乳酪杆菌，所述副干酪乳酪杆菌为副干酪乳酪杆菌a21151，分类学命名为lacticaseibacillus paracasei，于2022年12月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：gdmcc no:63042。

3、在本发明的一些实施方式中，所述副干酪乳酪杆菌a21151均分离自广西百岁老人的粪便样本。

4、在本发明的一些实施方式中，所述副干酪乳酪杆菌a21151的菌落形态均为圆形或椭圆形，菌落表面光滑，呈白色或乳白色，无芽孢，革兰氏染色呈阳性。

5、在本发明的一些实施方式中，所述副干酪乳酪杆菌a21151的16s序列如seq idno:3所示。

6、在本发明的一些实施方式中，所述副干酪乳酪杆菌a21151的筛选分离方法为：取广西百岁老人的粪便样本稀释涂布于mrs平板，挑选培养基中菌落形态为圆形或椭圆形，菌落表面光滑，呈白色或乳白色，无芽孢的菌落，分离、纯化，经pcr扩增鉴定后即得。

7、在本发明的一些实施方式中，所述副干酪乳酪杆菌a21151的培养时间为16～48h。

8、在本发明的一些实施方式中，所述副干酪乳酪杆菌a21151的培养温度为32℃～37℃。

9、在本发明的一些实施方式中，所述pcr扩增鉴定是以副干酪乳酪杆菌16s rdna作为目标扩增产物进行的。

10、在本发明的一些实施方式中，所述副干酪乳酪杆菌16s扩增引物如seq id no:1和2所示。

11、在本发明的一些实施方式中，所述pcr扩增鉴定的扩增体系为：1μl的1ng/μl基因组(作为模板)、引物27f(5’-agagtttgatcctggctcag-3’(seq id no：1))和引物1492r(5’-ggttaccttgttacgactt-3’(seq id no：2))各1μl、25μl的2×es taq mix以及22μl的ddh2o。

12、在本发明的一些实施方式中，所述pcr扩增鉴定的热循环参数设定为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，进行30次循环；72℃终延伸2min。

13、当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，合理调整pcr扩增体系中的含量与浓度，以及扩增程序，从而实现对于副干酪乳酪杆菌的鉴定。

14、本发明的第二个方面，提供含有本发明第一个方面所述副干酪乳酪杆菌的产品，所述产品包括食品、食品添加剂、饲料、饲料添加剂和药品。

15、在本发明的一些实施方式中，所述产品还包括含有本发明第一个方面所述副干酪乳酪杆菌的菌剂、菌液或其培养物、代谢物的产品。

16、在本发明的一些实施方式中，所述产品中的副干酪乳酪杆菌的质量分数大于等于1％。

17、在本发明的一些实施方式中，所述产品中的副干酪乳酪杆菌的质量分数大于等于5％。

18、在本发明的一些实施方式中，所述产品中的副干酪乳酪杆菌的质量分数大于等于10％。

19、在本发明的一些实施方式中，所述产品中的副干酪乳酪杆菌的质量分数为1％～15％。

20、在本发明的一些实施方式中，所述产品中还含有其他辅料。

21、在本发明的一些实施方式中，所述辅料包括药学上可接受的辅剂和食品添加剂。

22、在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的辅剂包括但不限于稀释剂(如淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇等)、吸收剂(如硫酸钙、磷酸氢钙等)、润湿剂(如乙醇)、粘合剂(如羟丙甲纤维素、聚维酮等)、崩解剂(如羟甲基淀粉钠、交联聚维酮等)、润滑剂(如滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇等)、着色剂(如二氧化钛、亚甲蓝等)、包衣材料、溶剂、ph调节剂、抗菌剂(如亚硫酸钠、硫代硫酸钠等)、等渗调节剂(如葡萄糖、氯化钠等)、螯合剂(如edta二钠)。

23、在本发明的一些实施方式中，所述食品添加剂包括但不限于着色剂、酶制剂、增稠剂、膨松剂、甜味剂。

24、在本发明的一些实施方式中，所述产品中的副干酪乳酪杆菌a21151的形式包括冻干粉、菌液、颗粒接种菌剂。当然，需要理解的是，本领域技术人员也可以根据实际使用需求和现有的处理工艺，合理选择适当的副干酪乳酪杆菌a21151形式用于使用，包括但不限于上述的冻干粉、菌液、颗粒接种菌剂。

25、在本发明中，术语“冻干粉”是指采用冷冻干燥机的真空冷冻干燥法预先将药液或菌液里面的水分冻结，然后在真空无菌的环境下将药液或菌液里面被冻结的水分升华，从而得到冷冻干燥而成的制品。

26、在本发明中，术语“颗粒接种菌剂”是指为了防止粉状菌剂在使用时直接与杀菌剂或化学化肥接触，导致效果降低而采用的菌剂，通常是指将菌液与颗粒状载体(如生物炭、蛭石等)混合后得到的菌剂类型。

27、在本发明的一些实施方式中，所述产品中的副干酪乳酪杆菌的有效菌活为107cfu/ml～1012cfu/ml。

28、当然，本领域技术人员可以根据所述产品中的副干酪乳酪杆菌a21151的实际形式合理调整其活性，从而实现稳定的技术效果。

29、本发明的第三个方面，提供一种含有本发明第一副干酪乳酪杆菌的食品，所述食品包括固体饮料和液体饮料。

30、在本发明的一些实施方式中，所述液体饮料包括发酵乳和乳酸菌液体饮料。

31、在本发明的一些实施方式中，所述食品中还包括全脂奶粉、低聚果糖、海藻糖、乳清蛋白粉、柠檬酸、麦芽糊精、卡拉胶、食用香精、牛乳、豆乳和干酪乳清蔗糖中的至少一种。

32、在本发明的一些实施方式中，所述食品为固体饮料，其原料包括全脂奶粉，低聚果糖，海藻糖，副干酪乳酪杆菌a21151菌株冻干粉，乳清蛋白粉，柠檬酸，麦芽糊精，卡拉胶和食用香精。

33、在本发明的一些实施方式中，按质量百分比计，所述固体饮料中包括全脂奶粉30-40％，低聚果糖5-10％，海藻糖5-10％，副干酪乳酪杆菌a21151菌株冻干粉5-15％，乳清蛋白粉5-10％，柠檬酸1-5％，麦芽糊精1-5％，卡拉胶1-5％，食用香精1-5％

34、在本发明的一些实施方式中，按质量百分比计，所述固体饮料中包括全脂奶粉40％，低聚果糖10％，海藻糖10％，副干酪乳酪杆菌a21151菌株冻干粉10％，乳清蛋白粉10％，柠檬酸5％，麦芽糊精5％，卡拉胶5％，食用香精5％。

35、在本发明的一些实施方式中，所述食品为发酵乳，所述发酵乳的原料包括副干酪乳酪杆菌a21151菌株冻干粉、纯牛乳。

36、在本发明的一些实施方式中，所述副干酪乳酪杆菌a21151菌株冻干粉的加入量为1-3％。

37、在本发明的一些实施方式中，所述发酵乳中的副干酪乳酪杆菌a21151活菌数大于1.0×109cfu/ml。

38、在本发明的一些实施方式中，所述发酵乳的制备方法为：以副干酪乳酪杆菌a21151菌株冻干粉与牛乳的混合发酵液为种子液，加入至牛乳中进行发酵得到。

39、在本发明的一些实施方式中，所述种子液的加入量为1～3％。

40、在本发明的一些实施方式中，所述发酵的温度为38～42℃，发酵时间为18-36h。

41、在本发明的一些实施方式中，在发酵结束后低温冷藏至少18h。

42、在本发明的一些实施方式中，所述低温是指4±2℃。

43、在本发明的一些实施方式中，所述食品为乳酸菌饮料，所述乳酸菌饮料的原料包括副干酪乳酪杆菌a21151、豆乳、干酪乳清和蔗糖。

44、在本发明的一些实施方式中，所述副干酪乳酪杆菌a21151的加入量为1-10％。

45、在本发明的一些实施方式中，所述乳酸菌饮料的原料包括5％接种量的副干酪乳酪杆菌a21151、100l豆乳、2kg干酪乳清和8kg蔗糖。

46、在本发明的一些实施方式中，所述发酵乳中的副干酪乳酪杆菌a21151活菌数大于1.0×109cfu/ml。

47、本发明的第四个方面，提供一种含有本发明第一个方面所述副干酪乳酪杆菌的微胶囊剂，所述微胶囊剂的原料包括海藻酸钠、变性淀粉、第一个方面所述副干酪乳酪杆菌和氯化钙。

48、在本发明的一些实施方式中，所述微胶囊剂的制备方法为：将海藻酸钠、变性淀粉与第一个方面所述的副干酪乳酪杆菌混合后雾化，然后喷入氯化钙中，固化1～3h即得。

49、本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面所述副干酪乳酪杆菌在制备食品、食品添加剂、饲料、饲料添加剂和药品中的用途。

50、在本发明中，副干酪乳酪杆菌a21151展现出优异的抗炎、降解核苷的能力，从而能够有效降低尿酸的生成，从而可以在食品、食品添加剂、饲料、饲料添加剂和药品领域中发挥极为重要的作用。

51、在本发明的一些实施方式中，所述食品、食品添加剂、饲料、饲料添加剂和药品具有如下(1)～(5)中至少一种功能：

52、(1)抑菌；

53、(2)抗炎；

54、(3)降解核苷

55、(4)降低血尿酸水平；

56、(5)调节肠道菌群结构。

57、在本发明的一些实施方式中，所述调节肠道菌群结构为调节高尿酸血症受试者或健康受试者的肠道菌群结构。

58、在本发明的一些实施方式中，所述受试者包括人和鼠。

59、在本发明的一些实施方式中，所述药品为治疗高尿酸血症的药品。

60、胞内尿酸水平过高可诱导白细胞信号通路重组及表观遗传修饰，从而引起对炎症信号的持续超敏反应，且可溶性尿酸与尿酸盐晶体可分别通过依赖或不依赖炎症小体的尿酸盐晶体机制及可溶性尿酸机制介导发挥潜在促炎作用，因此开发出具有抗炎作用的降血尿酸乳杆菌菌株，对于防治高尿酸血症和痛风这种急性、慢性、反复发作性炎性疾病具有重要意义。

61、在本发明中，发明人通过体内外试验有效的验证了本发明中的副干酪乳酪杆菌a21151具有极好的抑菌、抗炎、降解核苷和高尿酸血症模型小鼠肠道菌群的能力，从而可以进一步用于抑制尿酸生成以及治疗高尿酸血症，具有较高的应用价值。

62、本发明的有益效果是：

63、本发明首次发现了一株副干酪乳酪杆菌a21151菌株，且发现其除了能够降解及摄取尿酸生成的前提物核苷嘌呤，降低模型小鼠血尿酸的功能外，对lps诱导的炎症细胞raw264.7具有抗炎作用，能够显著降低了高尿酸血症模型小鼠肾脏中的炎症因子，具有抗炎的功能。基于该菌株，能够有效生产降嘌呤益生菌和低嘌呤食品，对预防、改善和治疗痛风以及高尿酸血症疾病具有重要意义。