一种基因工程菌株及其制备方法以及在无细胞蛋白质合成中的应用与流程

本发明属于生物，尤其是涉及一种通过敲除pat1基因来进一步提高无细胞合成体系中蛋白的合成能力。

背景技术：

1、无细胞蛋白质合成(cell-free protein synthesis,cfps)是一种以外源mrna或dna为模板，在体外条件下的使用酶、氨基酸底物和能量来合成蛋白质的技术。与传统的体内重组表达系统相比，体外无细胞合成系统具有多种优点，如能够直接以pcr产物作为模板同时平行合成多种蛋白质，可开展高通量多肽或蛋白质类药物筛选，此外，体外无细胞合成系统在表达对细胞有毒害作用的多肽或蛋白质的应用方面也具有独特优势。无细胞蛋白质表达系统是基于细胞的蛋白质表达系统的重要补充。

2、现有的无细胞蛋白质合成体系主要可以分为两类：其一是将获得的纯化的蛋白质合成所需的核糖体、酶、trna等按一定的比例进行组合复配，使其获得体外表达蛋白质的能力，即纯化的无细胞蛋白质表达系统(pure)。该系统具有清晰的组分信息，可以方便地、定制化地对配方进行调整以获得不同的蛋白质表达特性，但缺点是制备工艺流程复杂且成本高昂；另一类则是从具有蛋白质表达活性的活体细胞的提取物中获得主要活性物质，并适当添加所需的酶、底物、能量物质及其他组分，使其获得体外表达蛋白质的能力，即基于细胞提取物的无细胞蛋白质表达体系。相比于pure系统，后者具有操作流程简单、周期短、成本低等优点，但是后者也有系统内组分复杂、不可控因素多等缺点，因此对细胞提取物的来源细胞特性有更高的要求。本发明人多年来致力于基于细胞提取物的无细胞蛋白质表达平台技术的搭建，但是，目前该系统的配套技术流程及背景菌株仍存在巨大的优化空间。

3、pat1p是脱腺苷化依赖的mrna的去帽因子，也是一个拓扑异构酶(topoisomerase)ii相关蛋白，其在真核生物中具有非常保守的序列和功能。pat1p的c-末端能直接与去帽酶dcp2p和5'-3'mrna核酸外切酶xrn1p相互作用，增强去帽酶dcp1/2对5’-cap的去除并促进mrna的降解，其在蛋白质的翻译抑制中也扮演重要角色。pat1p可以在细胞质的p-body富集，并参与一部分mrna在胞质中的贮存。在细胞质中，pat1p可与lsm1-7p七聚体形成复合物介导mrna的降解，在细胞核中pat1/lsm2-8复合物可以参与pre-mrna的剪接修饰过程。在葡萄糖饥饿条件下，pat1p可以与mrna结合，尤其偏好与mrna的3’-utr或au-rich结构结合。研究显示，在酿酒酵母中pat1p对染色体的准确传递及维持rdna基因座稳定也具有重要作用。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：通过遗传改造，将细胞中原始存在的pat1基因敲除，从而提高无细胞蛋白质表达(dna to protein,d2p)体系的蛋白质表达水平，从而能够进一步实现无细胞蛋白合成体系节约成本、操作简单的目的。

2、本发明第一方面提供一种基因工程菌株，所述菌株中的pat1基因的表达或活性被降低。

3、进一步的，所述pat1基因的表达量≤10％，较佳地，≤5％，更佳地，≤2％；和/或将pat1基因的表达或活性降低满足以下条件：a1/a0的比值≤30％，较佳地≤10％，更佳地≤5％，更佳地，≤2％，最佳地为0-2％，其中，a1为所述基因工程菌株中pat1基因的表达或活性；a0为野生型pat1基因的表达或活性。

4、进一步的，所述的“降低”指pat1基因的表达量≤10％，较佳地，≤5％，更佳地，≤2％。

5、进一步的，所述的“降低”是指将pat1基因的表达或活性降低满足以下条件：a1/a0的比值≤30％，较佳地≤10％，更佳地≤5％，更佳地，≤2％，最佳地为0-2％，其中，a1为所述基因工程菌株中pat1基因的表达或活性；a0为野生型pat1基因的表达或活性。

6、进一步的，在另一优选例中，所述菌株中的pat1基因的表达或活性被降低通过选自下组的方式实现：基因编辑、基因突变、基因敲除、基因中断、rna干扰技术、或其组合；优选为基因编辑；更优选为crispr/cas9基因编辑技术。

7、进一步的，所述菌株中的pat1基因不表达或没有活性。

8、进一步的，通过基因编辑技术，将细胞中原始存在的pat1基因敲除，从而得到所述的基因工程菌株。

9、进一步的，细胞中原始存在的pat1基因被完全敲除。

10、进一步的，所述pat1基因的序列为seq id no.:7。

11、进一步的，所述的细胞选自哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞之一或其任意组合。

12、进一步的，所述的酵母细胞选自毕赤酵母(pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(pichia trehalophila)、科克拉马毕赤酵母(pichia koclamae)、膜醭毕赤酵母(pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(pichiaminuta)、甲醇诱导型酵母(ogataeaminuta)、林氏毕赤酵母(pichia lindneri)、仙人掌毕赤酵母(pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(pichiasalictaria)、松栎毕赤酵母(pichia g uercuum)、皮杰普毕赤酵母(pichia pijperi)、树干毕赤酵母(pichiastiptis)、甲醇毕赤酵母(pichia methanolica)、毕赤酵母菌(pichiasp.)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、啤酒酵母、甘蔗糖蜜酵母、酵母菌(saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、产朊假丝酵母、克鲁维酵母之一或其组合。

13、进一步的，所述的克鲁维酵母进一步包括：所述克鲁维酵母包括：乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces，k.lactis)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、多布克鲁维酵母(kluyveromyces dobzhanskii)、海泥克鲁维酵母(kluyveromyces aestuarii)、非发酵克鲁维酵母(kluyveromyces nonfermentans)、威克海姆克鲁维酵母(kluyveromyceswickerhamii)、耐热克鲁维酵母(kluyveromyces thermotolerans)、脆壁克鲁维酵母(kluyveromyces fragilis)、湖北克鲁维酵母(kluyveromyces hubeiensis)、多孢克鲁维酵母(kluyveromyces polysporus)、暹罗克鲁维酵母(kluyveromyces siamensis)、亚罗克鲁维酵母(kluyveromyces yarrowii)之一或其组合。

14、本发明第二方面提供一种本发明第一方面所提供的基因工程菌株的制备方法，通过基因编辑技术，将细胞中原始存在的pat1基因完全或部分敲除。

15、本发明第三方面提供一种无细胞蛋白质合成体系，该无细胞蛋白质合成体系至少包括细胞提取物，所述细胞提取物来自于本发明第一方面提供的基因工程菌株。

16、进一步的，所述合成体系还包括选自下组的一种或多种组分：用于合成rna的底物，用于合成蛋白的底物，聚乙二醇或其类似物，镁离子，钾离子，缓冲剂，rna聚合酶，能量再生系统，二硫苏糖醇(dtt)，任选的水或水性溶剂。

17、本发明第四方面提供本发明第一方面所述的基因工程菌株或本发明第二方面所述的基因工程菌株的制备方法或本发明第三方面提供的无细胞蛋白质合成体系在提高外源蛋白表达中的应用。

18、本发明第五方面提供一种提高无细胞蛋白合成体系中外源蛋白表达的方法，包括如下步骤：步骤(1)，提供无细胞蛋白质合成体系；步骤(2)，在步骤(1)的合成体系中加入编码外源蛋白的dna分子，在一定温度条件下，反应一段时间进行孵育，合成所述的外源蛋白。

19、进一步的，所述外源蛋白选自下组：荧光素蛋白、或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰trna合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、萤光素酶突变、α-淀粉酶、肠道菌素a、丙型肝炎病毒e2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素αa、细胞因子，干扰素α2b、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scfv)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、或其组合。

20、进一步的，所述的无细胞蛋白合成体系选自本发明第三方面提供的无细胞蛋白质合成体系。

21、进一步的，第五方面的方法还可以进一步包括步骤3：分离或检测所述外源蛋白。

22、进一步的，合适的条件包括反应温度为20-35℃，优选的为20-30℃，更优选的为25℃。

23、进一步的，孵育一段时间具体为0.5-20h，优选的为1-18h，更优选的为2-15h，更优选的为3-12h；上述反应时间可根据具体情况人为确定，也可以为3-15h，也可以为3-20h，也可以为具体的时间点，如3h、5h、10h、15h、18h、20h。

24、本发明第六方面提供一种试剂盒，所述的试剂盒包括容器以及位于所述容器中的如本发明第三方面提供的体外无细胞蛋白合成体系的组分。

25、本发明的主要优点包括：

26、(1)本发明通过基因定向改造以及活性测定，首次验证pat1基因表达或活性降低可以提高体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力；

27、(2)本发明通过crispr-cas9基因编辑技术对pat1进行基因敲除改造，从而提高体外蛋白质合成能力；

28、(3)通过体外无细胞蛋白合成体系验证基因敲除对蛋白表达的影响，并依托无细胞蛋白体系的低成本、试验方便等优点，为基因定向改造提供试验研究平台。

29、(4)所形成的体外无细胞蛋白合成体系能够进一步实现降低成本、提高蛋白表达通量、简化操作的目的。