工程化α-GALA肽及其功能变体和治疗法布里病的相关方法与流程

背景技术：

1、法布里病是一种x染色体连锁的溶酶体贮积疾病，其特征是α-半乳糖苷酶a(α-gala)缺乏，这可能导致鞘脂类，如球三糖基神经酰胺(gb3)和球三糖基鞘氨醇(lyso-gb3)，在血管内皮细胞、肾上皮细胞和内皮细胞、心肌细胞等的溶酶体中进行性和系统性积累。鞘脂沉积可能导致皮肤、心脏、肾脏、脑血管等疾病，最终导致病人过早死亡。

2、法布里病的治疗手段有限，包括酶替代疗法(ert)，它通过静脉注射递送重组人α-gal a(j med gene 2015may；52(5):353-8)。尽管ert可能有效，特别是在疾病的早期，但α-gal a的半衰期相对较短，患者通常需要定期输注(n engl j med。2001年7月5日；345(1):9-16)，造成终身负担。最近，口服药物伴侣被批准用于治疗法布里病，但它只对某些α-gal a突变有效。此外，临床试验中有三种重组腺相关病毒(raav)药物，每种药物都使用不同的raav血清型、特定启动子和其他机制来促进α-gal a的表达(nct04046224/nct05039886、nct04519749和nct04040049)。然而，raav介导的α-gal a的表达以及对疾病底物gb3和lyso-gb3的清除仍然有限。

3、尽管已有这些疗法，但对安全有效且具有持久效果的新型法布里病治疗方法仍有需求。

技术实现思路

1、本技术的一个目的是提供用于增加α-gal a表达的新组合物以及使用这种新组合物治疗法布里病和/或法布里病症状的相关方法。

2、除非另有说明，否则α-gal a是指野生型信号肽(wt sp)被切割后产生的成熟α-gal的氨基酸序列，或其功能变体；前体或全长α-gal a是指与一种或多种信号肽融合的α-gal，信号肽可以是wt sp或异源sp，例如但不限于表2中公开的sp1、sp2、…和sp22；hgla是指编码α-gal a的核苷酸序列，如野生型人α-半乳糖苷酶a(wt hgla)和编码α-gla a或其功能变体的优化/修饰的核苷酸序列(如本文公开的hgla c.o.v1)；小写字母sp是指信号肽或其功能变体，而大写字母sp是指编码信号肽或其功能变体的核苷酸序列。sp所指的信号肽可以是wt sp或某个异源sp，且编码信号肽的核苷酸序列sp可以是编码wt sp或某个异源sp的核苷酸序列。

3、在一些实施例中，所述组合物包含工程化肽，所述工程化肽包含α-gal a或其功能变体、组织纤溶酶原激活剂的信号肽(sp21)或其功能变体，以及可选的细胞穿膜肽或其功能变体。在一些实施例中，所述组合物包含病毒载体，所述病毒载体包含表达盒，所述表达盒包含第一个核苷酸序列编码α-gal a或其功能变体、第二个核苷酸序列编码sp21或其功能变体、可选的第三个核苷酸序列编码细胞穿膜肽或其功能变体，和启动子。

4、在一些实施例中，所述组合物包含工程化肽，所述工程化肽包含α-gal a或其功能变体、α-gal的野生型信号肽(wt sp)或其功能变体，以及可选的细胞穿膜肽或其功能化变体。在一些实施例中，所述组合物包含病毒载体，所述病毒载体包含表达盒，所述表达盒包含编码α-gal a或其功能变体的第一个核苷酸序列、编码wt-sp或其功能变体的第四个核苷酸序列，以及可选的编码细胞穿膜肽或其功能变体的第三个核苷酸序列和启动子。

5、本技术的另一个目的是提供通过给受试者施用所述组合物来治疗受试者的法布里病或减缓受试者法布里病的一种或多种症状的方法。

6、本技术的一个目的是提供通过向受试者施用所述组合物来增加受试者的一个或多个靶向组织中α-gal a表达的方法。

7、本技术的一个目的是提供通过向受试者施用所述组合物来降低受试者的一个或多个靶向组织中鞘脂贮积的方法。

8、这些和其他目的，在下面的详细描述和附图中可见。本技术包括包含或由α-gal a或其功能变体的一部分和异源信号肽至少一部分组成的工程化肽，以及编码所述工程化肽的病毒载体。本技术通过增加α-gal a表达、分泌、分布、和活性以治疗或减轻法布里病，产生有益的疾病治疗。

9、在一些实施例中，工程化肽包含α-gal a或其功能变体和异源信号肽(例如sp21)或其功能突变体。异源信号肽的其他实例包括但不限于sp1-sp20和sp22。在某些实施例中，异源信号肽选自本文公开的sp1、sp3、sp4、sp18、sp20和sp22组成的组。α-gal a或其功能变体可以包含也可不包含α-gal的野生型(wt)信号肽。

10、在一些方面，工程化肽还包括细胞穿膜肽或其功能变体。细胞穿膜肽的实例包括但不限于tat p47-57、tat p48-60、渗透素(penetratin)p43-58、hct(human calcitonin，人降钙素)p9-32、多聚精氨酸(r7-r25)、pvec、pep-1、转运素(transportan)和map。

11、在一些方面，α-gal a或其功能变体包含与seq id no:27具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的多肽序列。

12、在一些方面，sp1、sp3、sp4、sp18、sp20、sp21和sp22或其功能变体包含分别与seqid no:29、31、32、46、48、49和50具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的多肽序列。

13、在一些方面，信号肽或其功能变体包含与seq id no:29、31、32、46、48、49和50的多肽肽序列具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的多肽肽序列。

14、在一些方面，细胞穿膜肽或其功能变体包含一种多肽肽序列，所述多肽肽序列与选自tat p47-57(seq id no:55)、tat p48-60(seq id no:56)、渗透素p43-58(seq id no:57)、cf-hct p9-32(seq id no:58)、，多聚精氨酸(seq id no:59)、pvec(seq id no:60)、pep-1(seq id no:61)、转运素(seq id no:62)和map(seq id no:63)组成的组的多肽肽序列具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。

15、在一些方面，异源信号肽(例如sp21)或其功能变体与α-gal a或其功能变体部分的n末端融合。在某些方面，异源信号肽的部分(例如sp21)或其功能变体与α-gal a或其功能变体的c末端融合。在一些方面，异源信号肽的部分(例如sp21)或其功能变体融合在α-gal a或其功能变体内部。

16、在一些方面，细胞穿膜肽或其功能变体与α-gal a或其功能变体的c末端融合。在某些方面，细胞穿膜肽或其功能变体与α-gal a或其功能变体部分的n末端融合。在一些方面，细胞穿膜肽或其功能变体融合在α-gal a或其功能变体的内部。

17、在一些实施例中，本技术方案进一步包括具有编码工程化肽的核苷酸序列的病毒载体。

18、在一些方面，所述病毒载体进一步包含启动子。

19、在一些实施例中，本技术的组合物包含病毒载体，所述病毒载体包含表达盒，所述表达盒包含或由编码α-gal a或其功能变体部分的第一个核苷酸序列和编码异源信号肽(例如sp21)或其功能变体部分的第二个核苷酸序列组成。在一些实施例中，本技术的组合物包含具有表达盒的病毒载体，所述表达盒包含或由编码α-gal a或其功能变体部分的第一个核苷酸序列、编码wt-sp部分或其功能变体的第四个核苷酸序列组成，以及可选的编码细胞穿膜肽或其功能变体部分的第三个核苷酸序列和启动子。

20、在一些方面，第二个或第四个核苷酸序列位于第一个核苷酸序列的5’端，和/或第三个核苷酸序列位于第一个核苷酸序列的3’端。

21、本文所述的另一个方面是病毒载体，其中编码α-gal a或其功能变体部分的核苷酸序列与seq id no:25或26具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。

22、在一些方面，编码sp21或其功能变体部分的核苷酸序列与seq id no:22具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。

23、在一些方面，编码wt-sp部分或其功能变体部分的核苷酸序列与seq id no:1或51具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。

24、在一些方面，编码异源信号肽或其功能变体部分的核苷酸序列与seq id nos:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22和23具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。

25、在一些方面，编码异源信号肽或其功能变体部分的核苷酸序列与seq id nos:2、4、5、19、21、22和23的核苷酸序列至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性。

26、在一些方面，编码细胞穿膜肽或其功能变体部分的核苷酸序列与seq id no:24具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性。

27、在一些方面，编码细胞穿膜肽或其功能变体部分的核苷酸序列与seq id no:24、52、53和54的核苷酸序列至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性。

28、在一些方面，启动子是组织特异性启动子。

29、在一些方面，组织特异性启动子是肝脏特异性启动基因、心脏特异性启动子或肾脏特异性启动子。

30、在一些方面，肝脏特异性启动子是ttr启动子。

31、在一些方面，病毒载体还包括至少一个反向末端重复(itr)核苷酸序列、内含子和多聚腺苷酸化(polya)核苷酸序列。

32、在一些方面，病毒载体是修饰的重组腺相关病毒(raav)载体。

33、在一些实施例中，本技术还包括通过向受试者施用组合物来治疗受试者的法布里病或减缓受试者中法布里病的一种或多种症状的方法。

34、在一些实施例中，本技术还包括通过向受试者施用组合物来增加受试者的一个或多个靶向组织中α-gal a表达的方法。

35、在一些实施例中，本技术还包括通过向受试者施用组合物来减少受试者的一个或多个靶向组织中鞘脂贮积的方法。

36、在一些方面，受试者患有法布里病或具有法布里病的症状。

37、在一些方面，所述一个或多个靶向组织选自肝脏组织、心脏组织或肾脏组织。

38、在一些方面，所述方法还包括对受试者施用本技术的组合物。

39、在一些方面，本技术的组合物施用于受试者一次。

40、在一些方面，本技术的组合物通过系统全身给药施用于受试者。

41、在一些方面，本技术的组合物通过局部给药施用于受试者。

42、在一些方面，本技术的组合物通过特定器官给药施用于受试者。

43、在一些方面，包含本技术的病毒载体的组合物的病毒载体以1e+11vg/kg至5e+14vg/kg的一个或多个剂量施用于受试者。