一种干细胞培养方法与流程

本发明主要涉及干细胞的，具体为一种干细胞培养方法。

背景技术：

1、脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景，脐带间充质干细胞培养时，需先获取单细胞悬液，然后过贴壁培养的方法从中纯化获取间充质干细胞，贴壁培养缺陷在于，由于生长空间有限，培养时需要对一次贴壁生长的细胞进行吸除分离，以使一次贴壁生长的细胞分成多个组分进行二次贴壁生长。

2、根据申请号为cn202110530444.6的专利文献所提供的一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法可知，该专利公开了一种细胞高贴壁能力的干细胞原代培养方法，使用成分明确的原代培养基，且不含血清，避免血清培养基成分的不确定性及血清培养的不稳定性，同时提高了无血清培养基中细胞贴壁能力，减少了贴壁时间，提高了效率，且原代培养的人脐带间充质干细胞制备成工作库细胞具有良好的形态。

3、上述专利中的产品减少了贴壁时间，提高了效率，但不便于一次贴壁细胞的快速铺展培养。

技术实现思路

1、本发明主要提供了一种干细胞培养方法，用以解决上述背景技术中提出的技术问题。

2、本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：

3、一种干细胞培养方法，包括以下步骤：

4、步骤一、脐带的前处理，在无菌条件下取脐带一根，并在去除被膜以及血管后进行清洗除杂，以得到脐带一；

5、步骤二、脐带的粉碎，利用液氮对脐带进行冷冻并在冷冻后对脐带进行粉碎处理，以得到粉碎组织一；

6、步骤三、脐带组织的接种，将单位量的粉碎组织一按照单位间距置于细胞分块式培养盒内的多个拼接培养板上，并向细胞分块式培养盒内加入适量的含百分之十fbs的dmem/f12完全培养基，完成后将细胞分块式培养盒置于培养箱中，直至细胞贴壁融合生长覆盖每个拼接培养板；

7、步骤四、一次贴壁细胞的分切，利用模切分切装置对拼接培养板上的一次贴壁生长细胞进行分切；

8、步骤五、分切模块的培养，分切完成后将每块拼接培养板分别置于一个瓶底培养盒内，并加入适量的含百分之十fbs的dmem/f12完全培养基，完成后将瓶底培养盒置于培养箱中，直至拼接培养板上的细胞铺展贴壁覆盖瓶底培养盒底部；

9、步骤六、贴壁空间的扩展，将瓶底培养盒拼接瓶罩，并将拼接后的瓶底培养盒与瓶罩置于培养箱中，待细胞贴壁生长至瓶罩内壁，即可完成细胞培养工作。

10、优选的，所述细胞分块式培养盒内壁底部通过第一磁吸部件磁吸连接拼接培养板，所述细胞分块式培养盒底部穿设有多个上顶移块部件，其中一个所述上顶移块部件与其中一个所述拼接培养板位置对应。在本优选的实施例中，通过细胞分块式培养盒以及拼接培养板的结构便于细胞一次贴壁后的分块处理，分块处理的细胞可继续培养，增大细胞铺展速度，避免细胞重复贴壁，节约了培养时间。

11、优选的，所述第一磁吸部件包括设于所述拼接培养板底部的橡胶圈，设于所述拼接培养板底部且位于所述橡胶圈内环的第一磁环，以及设于所述细胞分块式培养盒内壁底部且与所述第一磁环位置对应的第二磁环。在本优选的实施例中，通过第一磁吸部件便于拼接培养板与细胞分块式培养盒间的稳定固定。

12、优选的，所述上顶移块部件包括位于所述细胞分块式培养盒内壁底部且与所述拼接培养板位置对应的升降盘，以及位于所述细胞分块式培养盒底部且顶端贯穿所述细胞分块式培养盒底部连接所述升降盘底部的升降杆。在本优选的实施例中，通过上顶移块部件便于顶起拼接培养板，以便于将拼接培养板移出细胞分块式培养盒。

13、优选的，所述模切分切装置包括定位模架，对称设于所述细胞分块式培养盒两侧且用于弹性支撑定位模架的多个弹力支撑部件，以及嵌设于所述定位模架底部的切刀部件。在本优选的实施例中，通过模切分切装置便于按照拼接培养板的尺寸对一次贴壁细胞进行分切。

14、优选的，每个所述拼接培养板顶部均设有方环形凸起，所述方环形凸起的截面呈半圆形，所述定位模架底部设有与所述方环形凸起外缘相匹配的环形凹槽，所述定位模架顶部且位于两个环形凹槽间设有刀槽。在本优选的实施例中，通过方环形凸起与环形凹槽之间的配合便于在一次贴壁细胞分切前，以方环形凸起为界线对一次性贴壁细胞进行固定，降低分切过程中对拼接培养板顶部细胞的影响。

15、优选的，所述切刀部件包括设于所述刀槽内的模切刀，位于所述定位模架上部的模切手动环板，顶部连接所述模切手动环板底部、底端贯穿所述定位模架连接所述模切刀顶部的传动杆，以及套设于所述传动杆外壁且位于所述模切手动环板与所述定位模架间的第一弹簧。在本优选的实施例中，通过切刀部件便于进行分切加工，同时模切刀可自动复位，降低手动复位的操作失误可能。

16、优选的，所述弹力支撑部件包括设于所述细胞分块式培养盒外壁的导套，设于所述导套内的第二弹簧，以及设于所述定位模架外壁且底部延伸至所述导套内的导柱。在本优选的实施例中，通过弹力支撑部件不仅可以起到细胞分块式培养盒与定位模架间的导向作用，同时弹力支撑部件给予细胞分块式培养盒与定位模架间分离弹力，避免手动抽出定位模架产生勿动的可能。

17、优选的，所述瓶底培养盒内壁底部设有与拼接培养板匹配的固定凹槽，所述固定凹槽内设有用于磁吸固定拼接培养板的第二磁吸部件，所述第二磁吸部件与所述第一磁吸部件结构相同。在本优选的实施例中，通过瓶底培养盒便于对拼接培养板进行固定，同时便于拼接培养板上的分切贴壁细胞的继续铺展生长。

18、优选的，所述瓶罩底部设有用于连接瓶底培养盒的螺纹环，所述瓶底培养盒内壁设有弧形面，所述弧形面最低点低于拼接培养板顶部，所述弧形面顶部与所述瓶罩内壁共面。在本优选的实施例中，通过弧形面便于在培养基搅拌时在液体漩涡中露出拼接培养板的贴壁细胞，以便于贴壁细胞与空气以及培养基交替接触，以便于贴壁细胞更好的生长。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

20、本发明中的制备工艺便于一次贴壁细胞的快速铺展培养，避免了细胞重复贴壁对培养速率产生的影响；

21、通过细胞分块式培养盒以及拼接培养板的结构便于细胞一次贴壁后的分块处理，分块处理的细胞可继续培养，增大细胞铺展速度，避免细胞重复贴壁，节约了培养时间；

22、通过第一磁吸部件便于拼接培养板与细胞分块式培养盒间的稳定固定，通过上顶移块部件便于顶起拼接培养板，以便于将拼接培养板移出细胞分块式培养盒；

23、通过模切分切装置便于按照拼接培养板的尺寸对一次贴壁细胞进行分切，通过方环形凸起与环形凹槽之间的配合便于在一次贴壁细胞分切前，以方环形凸起为界线对一次性贴壁细胞进行固定，降低分切过程中对拼接培养板顶部细胞的影响，通过切刀部件便于进行分切加工，同时模切刀可自动复位，降低手动复位的操作失误可能，通过弹力支撑部件不仅可以起到细胞分块式培养盒与定位模架间的导向作用，同时弹力支撑部件给予细胞分块式培养盒与定位模架间分离弹力，避免手动抽出定位模架产生勿动的可能；

24、通过瓶底培养盒便于对拼接培养板进行固定，同时便于拼接培养板上的分切贴壁细胞的继续铺展生长，通过弧形面便于在培养基搅拌时在液体漩涡中露出拼接培养板的贴壁细胞，以便于贴壁细胞与空气以及培养基交替接触，以便于贴壁细胞更好的生长。

25、以下将结合附图与具体的实施例对本发明进行详细的解释说明。

26、附图说明

27、图1为本发明的整体工艺流程图；

28、图2为本发明的细胞分块式培养盒整体结构轴测图；

29、图3为本发明的细胞分块式培养盒以及模切分切装置爆炸图；

30、图4为本发明的模切分切装置爆炸图；

31、图5为本发明的细胞分块式培养盒结构爆炸图；

32、图6为本发明的细胞分块式培养盒以及模切分切装置剖视图；

33、图7为本发明的a处结构放大图；

34、图8为本发明的切刀部件结构剖视图；

35、图9为本发明的瓶底培养盒以及瓶罩轴测图；

36、图10为本发明的瓶底培养盒以及瓶罩爆炸图；

37、图11为本发明的瓶底培养盒以及瓶罩剖视图。