猫叫综合征基因敲除非人动物模型的构建方法及应用

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于crispr/cas9技术的基因敲除非人动物模型的构建方法及应用。

背景技术：

1、猫叫综合征(cri du chat syndrome)由于第五号染色体短臂部分或全部缺失(5pmicrodeletion,5p缺失)所致的染色体结构异常的遗传性神经发育障碍疾病，又称5p缺失综合征或者小儿猫叫综合征，不同个体的猫叫综合征患者(简称5p患者)的5号染色体短臂的缺失大小不同，缺失大小从0.5mb到45mb(缺失位置从5p15区域到整个短臂)。

2、国际上，nguyen等人(2015年)确定了11个5p臂内的基因与猫叫综合征发病相关，其中tert、sema5a、marchf6、ctnnd2和npr3这5个基因单倍体缺失可直接导致猫叫综合征，剩下的6个基因的单倍体缺失加上环境因素改变也可导致猫叫综合征，这6个基因分别是slc6a3，cdh18、cdh12、cdh10、cdh9和cdh6。此外，rictor和dab2单倍体缺失也可引起猫叫综合征。nevado等人(2021年)应用高分辨率单核苷酸多态性(snp)阵列、细胞遗传学、原位荧光杂交(fish)和多重连接探针扩增(mlpa)技术，对70例无血缘关系、平均年龄9岁的5p患儿进行了队列分子诊断研究，确定了多数患儿5p缺损的大小、范围、基因含量和基因重排的遗传信息，根据临床和分子数据，建立了5p患儿的基因型-临床表型关系。结合另外7家课题组数据，通过对423例5p患儿的meta分析，nevado等人发现约95％-99％患儿有发育迟缓和肌张力过低，约80％患儿有暴力攻击行为和其它行为异常，65％患儿有小头畸形和智力低下，42％患儿具有孤独症的临床表现，33％-36％患儿伴随心脏和胃肠障碍。此外，约95％5p女孩并发癫痫，而只有不到6％的5p男孩有癫痫，原因不明。

3、现有关于研究猫叫综合征的方法大多数以临床研究或流行病学研究为主，队列研究是流行病学研究方法之一，选择暴露及未暴露于某因素的两组人群或按暴露程度分为不同的亚组，追踪其各自的发病结局(发病率和死亡率)，并比较两组或各组发病结局的差异，从而判定暴露因素与发病有无因果关联及关联程度的一种观察性研究方法。但是关于猫叫综合征基因敲除动物模型的构建方法目前还未见报道。

技术实现思路

1、本发明的猫叫综合征非人动物模型具有一些独特的优点：实验条件易于控制；非人动物生产繁殖快，较临床研究时间短；非人动物的繁育在房舍、设备、饲料、管理等各方面都比较经济。

2、本发明的猫叫综合征模型不但验证了猫叫综合征关键基因，也为深入研究这个儿童神经系统罕见病打下了坚实基础。与现有的临床研究和流行病学研究相比，能够深入机制方面的研究，能够更好地控制试验中的实验条件，与临床研究相比，更省时间。

3、本发明提供了一种基因敲除非人动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

4、s1，确定特异性靶位点sgrna1和sgrna2，并与cas9核酸酶体外转录成mrna；

5、s2，将有活性的sgrna1、sgrna2和cas9rna显微注射入非人哺乳受精卵中，获得基因敲除非人动物；

6、所述sgrna1选自由seq id no：5-12组成的组中的序列，所述sgrna2选自由seq idno：14-26组成的中的序列；优选地，所述sgrna1如seq id no：7所示，所述sgrna2如seq idno：24所示。

7、在一些实施方案中，步骤s2包括以下步骤：

8、s21，非人动物促排卵和体外受精，培育受精卵；

9、s22，将有活性的sgrna1、sgrna2和cas9rna显微注射到非人动物受精卵中；

10、s23，受精卵体外培养、植入受体及靶向基因修饰动物的培育。

11、在一些实施方案中，步骤s23包括以下步骤：

12、s231，取注射后存活的受精卵移植到成熟雌性非人动物体内，产出非人动物，即为f0代非人动物；

13、s232，提取f0代非人动物尾部dna，pcr扩增并将产物送测序；

14、s233，将阳性f0代非人动物与野生型异性非人动物交配获得f1代杂合子非人动物；

15、s234，将f1代杂合子非人动物杂交获得f2代纯合子非人动物，即为非人动物模型。

16、在一些实施方案中，所述阳性f0代非人动物中删除了大约1.68mb个碱基。

17、在一些实施方案中，所述阳性f0代非人动物中删除的碱基序列为chr2基因的第83120000位至第84800000位区域的dna片段。

18、所述非人动物为非人哺乳动物，优选为大鼠。因此，本发明进一步公开了一种基因敲除大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

19、s1，确定特异性靶位点sgrna1和sgrna2，并与cas9核酸酶体外转录成mrna；

20、s2，将有活性的sgrna1、sgrna2和cas9rna显微注射入大鼠受精卵中，获得基因敲除大鼠；

21、所述sgrna1选自由seq id no：5-12组成的组中的序列，所述sgrna2选自由seq idno：14-26组成的组中的序列；优选地，所述sgrna1如seq id no：7所示，所述sgrna2如seqid no：24所示。

22、在一些实施方案中，步骤s2包括以下步骤：

23、s21，大鼠促排卵和体外受精，培育受精卵；

24、s22，将有活性的sgrna1、sgrna2和cas9rna显微注射到大鼠受精卵中；

25、s23，受精卵体外培养、植入受体及靶向基因修饰动物的培育。

26、在一些实施方案中，步骤s23包括以下步骤：

27、s231，取注射后存活的受精卵移植到成熟雌性大鼠体内，产出大鼠，即为f0代大鼠；

28、s232，提取f0代大鼠尾部dna，pcr扩增并将产物送测序；

29、s233，将阳性f0代大鼠与野生型异性大鼠交配获得f1代杂合子大鼠；

30、s234，将f1代杂合子大鼠杂交获得f2代纯合子大鼠，即为非人动物模型。

31、在一些实施方案中，所述阳性f0代大鼠中删除了大约1.68mb个碱基。

32、在一些实施方案中，所述阳性f0代大鼠中删除的碱基序列为chr2基因的第83120000位至第84800000位区域的dna片段。

33、另一方面，本发明提供了一种基因打靶载体，其特征在于，所述载体是基于crispr/cas9系统的sgrna表达载体，其中sgrna1选自由seq id no：5-12组成的组中的序列，sgrna2选自由seq id no：14-26组成的组中的序列；优选地，所述sgrna1如seq id no：7所示，所述sgrna2如seq id no：24所示。

34、另一方面，本发明提供了一种如权利要求8所述的sgrna在构建猫叫综合征相关的基因敲除非人动物模型中的用途。