一种抗非洲猪瘟病毒pB602L蛋白的单克隆抗体

本技术属于抗体制备，具体涉及一种抗非洲猪瘟病毒pb602l蛋白的单克隆抗体。

背景技术：

1、非洲猪瘟的病原体非洲猪瘟病毒(asfv)，是阿斯法尔病毒科、阿斯菲病毒属唯一成员，也是一种大型的包膜双链dna病毒，基因组含有约170至193kbp的双链dna，两侧都有反向末端的重复序列。基因组包含150至167个基因，包括那些参与病毒复制和组装、宿主细胞功能调节和免疫逃逸的基因，但目前对其中大约40种蛋白的实际功能仍然不够清楚。

2、asfv可以感染野猪和家猪，死亡率高达100％，而且传播迅速，因此，对于生猪养殖行业影响巨大。

3、疫苗开发是asfv防治的重要技术路径，但asfv疫苗或治疗方案的开发受病毒基因组复杂性、宿主-病毒相互作用信息不足以及许多未知基因研究缺少造成阻碍。因此，现有技术中，非洲猪瘟的防治仍然没有较好的措施，早期诊断仍是最为重要的预防策略。

技术实现思路

1、基于现有的高致病性pig/hlj/2018asfv毒株，本技术目的在于提供一种抗pb602l蛋白的单克隆抗体及该单克隆抗体所识别的最小b细胞表位，基于该研究工作结果，对于asfv的检测、疫苗靶点挖掘及新型疫苗研究具有重要意义。

2、本技术所提供的技术方案详述如下。

3、一种抗非洲猪瘟病毒pb602l蛋白的单克隆抗体，包括重链和轻链两部分，重链亚类为igg2a，轻链为κ型；

4、重链和轻链的氨基酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示，其核苷酸序列分别为seq id no.3和seq id no.4所示；具体如下：

5、重链氨基酸序列(seq id no.1，120个aa)：

6、qvqlkqsgpglvqpsqslsitctvsgfsltnycvhwvrqspgkglewlgviwsggstdyn aafisrlsiskdnsksqvffkmnslqandtaiyycaslygnsyvramdywgqgtsvtvss；重链可变区cdr的氨基酸序列分别为gfsltnyc、iwsggst、aslygnsyvramdy(其对应的核苷酸序列分别为：ggtttctcattaactaactattgt、atatggagtggtggaagcaca

7、、gccagcctttacggtaatagctacgtgagggctatggactac)。

8、轻链氨基酸序列(seq id no.2，111个aa)：

9、divltqspaslvvslgqratiscrasksvstsgysymhwyqqkpgqppklliylasnlesgv parfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhcrelpltfgagtklelk；

10、轻链可变区cdr的氨基酸序列分别为ksvstsgysy、las、qhcrelplt(其对应的核苷酸序列分别为：aaaagtgtcagtacatctggctatagttat、cttgcatcc、cagcactgtagggagcttccgctcacg)；

11、重链核苷酸序列(seq id no.3，360bp)：

12、caggtgcagctgaagcagtcaggacctggcctagtgcagccctcacagagcctgtcca

13、tcacctgcacagtctctggtttctcattaactaactattgtgtacactgggttcgccagt

14、ctccaggaaagggtctggagtggctgggagtgatatggagtggtggaagcacagacta

15、taatgcagctttcatatccagactgagcatcagcaaggacaattccaagagccaagttt

16、tctttaaaatgaacagtctgcaagctaatgacacagccatatattactgtgccagccttt

17、acggtaatagctacgtgagggctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca；

18、轻链核苷酸序列(seq id no.4，333bp)：

19、gacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagttgtatctctggggcagagggccacc

20、atctcatgcagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggtac

21、caacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcttgcatccaacctagaatc

22、tggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatcc

23、atcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcactgtagggagcttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa。

24、所述抗非洲猪瘟病毒pb602l蛋白的单克隆抗体体所识别的线性b细胞抗原表位，抗原表位对应氨基酸序列如seq id no.5所示，具体为：skenltpde。

25、所述抗非洲猪瘟病毒pb602l蛋白的单克隆抗体，具体通过如下步骤制备获得：

26、(一)制备猪瘟病毒pb602l重组蛋白

27、基于asfv b602l基因序列(genbank:mk333180.1)，采用原核表达方式，制备获得重组的猪瘟病毒pb602l重组蛋白，以此作为抗原；

28、(二)免疫注射

29、以balb/c小鼠为接种对象，注射步骤(一)中所制备抗原以进行免疫；

30、(三)筛选杂交瘤

31、利用步骤(二)中免疫注射小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选、鉴定获得杂交瘤细胞系；

32、(四)获得单克隆抗体

33、将步骤(三)筛选所得杂交瘤细胞系注射balb/c小鼠，收集注射10～14d后的腹水，进一步纯化获得单克隆抗体。

34、所述抗非洲猪瘟病毒pb602l蛋白的单克隆抗体在制备asfv检测试剂中的应用，用于检测生物体是否受到asfv感染。

35、pb602l是一种病毒复制晚期的非结构蛋白，已有研究认为其具有较强免疫原性，可用于开发asfv诊断工具。部分研究认为，pb602l作为一种分子伴侣，在病毒工厂外参与了p72核衣壳蛋白的折叠。而pb602l的缺失会导致异常的拉链状结构，进而使得病毒不能形成二十面体病毒颗粒。另外，先前的研究表明，pb602l对感染asfv后的猪恢复期血清具有特异反应。此外，在猪表现asfv临床现象时，可用于区分猪是由asfv野生毒株感染还是亚单位疫苗免疫造成的。然而，pb602l抗原性的结构基础及其对p72的作用机制尚未足够清楚，这也导致以pb602l为“靶点”的相关研究较为受限。

36、鉴于asfv pb602l作为最具免疫优势的抗原之一，发明人制备了相关重组蛋白，并利用elisa法测定了asfv阳性血清中pb602l-特异性igg的滴度，结果表明，感染asfv后，其特异性igg滴度为1:25600。随后，利用所制备pb602l重组蛋白并免疫小鼠，获得了一个抗asfv pb602l小鼠的单克隆抗体7e7。经过检测验证，该单克隆抗体7e7可特异性结合asfvpig/hlj/2018毒株。进一步通过相关表位鉴定，确定了具体的结合位点序列。

37、总之，本技术通过制备相关单克隆抗体，并获得其识别的最小线性表位，对了解非洲猪瘟病毒抗体和抗原之间的相互作用模式分析、asfv的早期检测、疫苗靶点挖掘和新型疫苗设计等具有重要意义。