自交联重组人源化胶原蛋白高分子生物材料及其制备方法与流程

本发明属于合成生物，具体涉及自交联重组人源化胶原蛋白高分子生物材料及其制备方法；更具体涉及一种促进重组iii型人源化胶原蛋白自交联形成三螺旋结构的胶原蛋白自组装元件及相应的具有三螺旋结构的重组iii型人源化胶原蛋白。

背景技术：

1、胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体含量最多的蛋白质，可以占到蛋白质总量的25％～35％。胶原蛋白的主要功能体现在维护细胞外环境，维持组织器官的正常生理功能，以及修复肌体损伤等方面。胶原蛋白是天然的生物资源，具有其它高分子材料所望尘莫及的生物组织相容性，对细胞的支撑弹性和可降解性。因此，胶原蛋白可以广泛的应用在医药和化妆品等行业中。

2、天然胶原分子可形成一种特殊的超螺旋结构，这种结构是以3个氨基酸残基为基本重复体的左手螺旋，这三个氨基酸残基通常为gly-x-pro。gly对胶原蛋白中氢键的形成是必须的，其本身没有侧链，从而使胶原蛋白紧密堆积。在更高级的结构层次上，胶原超螺旋会进一步缔合成为胶原原纤维。在生物体中，胶原蛋白的合成和修饰从原胶原开始，经历了羟基化、糖基化、相互交联等诸多化学变化，受到了多种生物酶的复杂调控。原胶原除了含有胶原链之外，还含有球状的头部和尾部。没有这些头部和尾部，胶原链就不会折叠成为正确的三螺旋，从而缺乏胶原蛋白的生物学活性。因此，按照原始基因序列制备的胶原蛋白在体外很难自发的组织形成正确的空间结构。这样的困难严重阻碍了人胶原蛋白的研发和生产。

3、人们对此进行了适当的探索研究，例如引用文献1公开可以在表达多肽的c末端加入铰链区氨基酸gppgpccggg(seq id no.15)等序列帮助成胶。然而引用文献2公开，如果在其提供的多肽序列的c末端加入上述如seq id no.15所示的铰链区氨基酸时，会使得该多肽在发酵培养的时候形成胶状沉淀导致无法溶解提纯，得率大大降低。

4、因此，目前亟需一种能够促进重组iii型人源化胶原蛋白交联形成三螺旋结构的方法，使得重组iii型人源化胶原蛋白能够通过生物合成的方法大量生产，且能够具有三螺旋结构并发挥其特定的功能。

5、此外，圆二色光谱技术是用来检测蛋白质二级结构的一种方法。其检测天然胶原蛋白时，在合适的检测条件下会出现221nm附近的吸收峰。这个吸收峰与其三螺旋结构存在一定关系，但同时受到脯氨酸、羟脯氨酸含量等的影响(多聚脯氨酸本身就有很强的221nm峰，但是不形成三螺旋)。因此圆二色光谱不能作为三螺旋结构的直接证据。但是由于圆二色光谱实验检测简单，因此可用于辅助表征胶原蛋白高级结构。针对不同的胶原蛋白，圆二色光谱实验的条件和结果差异很大，主要原因是重组胶原蛋白的序列长度和氨基酸组成(尤其是脯氨酸、羟脯氨酸的含量)与天然全长胶原蛋白不同，因此不同的胶原蛋白的圆二色光谱检测条件(温度、浓度、溶液配方等)无法保持一致。为了表征胶原蛋白能否形成三螺旋(比如生产中变性的胶原蛋白或者设计有缺陷的胶原蛋白完全无法形成三螺旋结构)，可通过圆二色光谱在不同条件下对胶原蛋白进行表征。

6、引用文献：

7、引用文献1：yao j,yanagisawa s,asakura t.design,expression andcharacterization of collagen-like proteins based on the cell adhesive andcrosslinking sequences derived from native collagens.j biochem.2004nov；136(5):643-9.

8、引用文献2：cn 109593126 b。

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、目前，现有技术已经对例如按照原始基因序列制备的胶原蛋白在体外很难自发的组织形成正确的空间结构，导致其无法有效发挥生理功能的问题进行了适当的研究，但其仍然不能说是充分的。对此，本发明提供了一种胶原蛋白自组装元件，其能够促进重组iii型人源化胶原蛋白自交联形成三螺旋结构，通过使重组iii型人源化胶原蛋白的氨基酸序列的末端含有人iii型胶原蛋白铰链区的氨基酸序列，帮助重组iii型人源化胶原蛋白自交联形成三螺旋结构，且该具有三螺旋结构的重组iii型人源化胶原蛋白生物材料能够通过生物合成的方法顺利制备。

3、用于解决问题的方案

4、本发明第一方面提供了一种胶原蛋白自组装元件，所述胶原蛋白自组装元件包含如下(i)～(iii)中任一项所示的序列：

5、(i)如seq id no.1所示的氨基酸序列的c端的至少21个连续的氨基酸；

6、(ii)如(i)所述的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且保留促进重组iii型人源化胶原蛋白自交联形成三螺旋结构的功能的氨基酸序列；

7、(iii)与(i)所述的氨基酸序列具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，且保留促进重组iii型人源化胶原蛋白自交联形成三螺旋结构的功能的氨基酸序列。

8、在一些实施方案中，所述(i)所示的序列为如seq id no.1、seq id no.2、seq idno.3或seq id no.4所示的氨基酸序列。

9、本发明第二方面提供了根据本发明第一方面所述的胶原蛋白自组装元件在用于促进重组iii型人源化胶原蛋白自交联形成三螺旋结构中的用途。

10、在一些实施方案中，所述胶原蛋白自组装元件通过存在于所述重组iii型人源化胶原蛋白的氨基酸序列的末端发挥作用；

11、优选地，所述重组iii型人源化胶原蛋白的氨基酸序列的末端为c末端。

12、本发明第三方面提供了一种重组iii型人源化胶原蛋白，所述重组iii型人源化胶原蛋白的末端包含根据权利要求1或2所述的胶原蛋白自组装元件；

13、优选地，所述重组iii型人源化胶原蛋白的末端为c末端。

14、在一些实施方案中，所述重组iii型人源化胶原蛋白包含如下(a)～(c)中任一项所示的序列：

15、(a)如seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8或seq id no.9所示的氨基酸序列；

16、(b)如(i)所述的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，且保留自交联形成三螺旋结构能力的氨基酸序列；

17、(c)与(i)所述的氨基酸序列具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，且保留自交联形成三螺旋结构能力的氨基酸序列。

18、本发明第四方面提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码根据本发明第一方面所述的胶原蛋白自组装元件，或编码根据本发明第三方面所述的重组iii型人源化胶原蛋白。

19、在一些实施方案中，所述多核苷酸包含如下(z1)或(z2)所示的序列：

20、(z1)如seq id no.11、seq id no.12、seq id no.13或seq id no.14所示的核苷酸序列；

21、(z2)在严格条件下与(z1)所示的核苷酸序列杂交且编码具有自交联形成三螺旋结构能力的蛋白的核苷酸序列，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。

22、本发明第五方面提供了重组表达载体，所述重组表达载体包含根据本发明第四方面所述的多核苷酸。

23、本发明第六方面提供了重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含根据本发明第五方面所述的重组表达载体。

24、本发明第七方面提供了根据本发明第三方面所述的重组iii型人源化胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

25、s1：构建包含根据第四方面所述的编码根据第三方面所述的重组iii型人源化胶原蛋白的多核苷酸的重组表达载体，并通过转化构建重组宿主细胞；

26、s2：在培养基中培养s1获得的所述重组宿主细胞并生产蛋白；

27、s3：收获并纯化所述蛋白，优选用ni柱和/或阴离子交换层析纯化所述蛋白；和

28、s4：任选地对所述蛋白进行酶切，优选用tev蛋白酶酶切蛋白。

29、发明的效果

30、通过上述技术方案的实施，本发明取得了如下技术效果：

31、首先，本发明提供了一种胶原蛋白自组装元件，通过使重组iii型人源化胶原蛋白的氨基酸序列的末端含有该胶原蛋白自组装元件，也即含有人iii型胶原蛋白铰链区的氨基酸序列，可以有效的帮助重组iii型人源化胶原蛋白自交联形成三螺旋结构，大大提高了通过生物合成方法制备的重组iii型人源化胶原蛋白的可利用性。

32、同时，本发明提供的末端包含胶原蛋白自组装元件，也即包含人iii型胶原蛋白铰链区的氨基酸序列的重组iii型人源化胶原蛋白可以形成良好的三螺旋结构，该结果得到了圆二色光谱检测结果的支持。并且该重组iii型人源化胶原蛋白能够通过生物合成的方法大量制备。