一种应用酮还原酶MrADH不对称合成NEB-8的方法

本发明涉及一种应用酮还原酶mradh不对称合成neb-8的方法，属于生化工程。

背景技术：

1、盐酸奈必洛尔(nebivolol hydrochloride)，(双[2-(6-氟苯并二氢吡喃-2-基)-2-羟基乙基]胺盐酸盐)由美国强生公司研发，1997年首次在德国和荷兰上市，片剂商品名nebilet，是一种血管扩张活性的选择性β1肾上腺素受体拮抗剂，用于轻至中度高血压病人的治疗，亦可用于心绞痛和充血性心力衰竭的治疗，具有疗效显著、服用方便、不良反应小等特点。奈必洛尔含有四个手性中心，理论上存在16个对映体，但实际上因存在对称平面，只有10个对映异构体。临床用药主要是其(r,s,s,s)-对映体，(s,r,r,r)-对映体的混合物。体外实验表明，强大的β1受体阻滞作用主要来自于其(s,r,r,r)-对映体，而(r,s,s,s)-对映体则表现出内皮细胞依赖性血管扩张作用，其它药理作用则依赖于二者共同作用。产生neb-8(r,s)的方法主要有化学和生物不对称还原两种。化学不对称还原存在选择性低，催化剂昂贵，反应条件苛刻的缺点。而生物不对称还原的方法具有高立体选择性，高反应效率，条件温和等优点，因而受到越来越多的关注。然而，以往的研究主要存在以下两个问题：1.奈必洛尔中间体位阻较大，仅有较少的酮还原酶被报道具有催化活性。2.现有的酮还原酶对奈必洛尔中间体的立体选择性不高。两种具有药用价值的奈必洛尔拆分反应式如下：

2、

3、1989年，专利ep145067中杨森(janssen)公开了色满醛与碘代三甲基氧硫盐在氢钠作用下得到一对非对映异构体环氧化中间体，环氧中间体经层析分离与苄胺进行交叉偶联反应得到d-奈必洛尔的色满酸合成法。

4、2000年，ohannes，c.-w从手性原料出发，合成(s,s)-2-羟基-2-(6-氟-3，4-二氢-2h-1-苯并吡喃-2)-乙醛和(r,r)-2-羟基-2-(6-氟-3，4-二-2h-1-苯并吡喃-2)-乙基苄胺，两者经缩合还原后得到目标化合物，但该路线太长，所用试剂昂贵。

5、2005年，杨运旭等以6-氟苯酚为原料，再使用d-(+)-α-苯乙胺做拆分试剂，总拆分效率仅为20％。

6、2006年，专利cn101243062公开了用消旋色满醛与亚硫酸氢钠和氰化钠反应得到外消旋盐酸奈必洛尔的氰化衍生物法。

7、2015年，专利文献w02008/010022a2公开的奈必洛尔的制备方法，合成效率较高，但该方法会产生较大比例的无法应用的副产物，需要采用繁琐的衍生化或重结晶步骤进行纯化除去所述副产物；而同时生成的产物无法进行拆分，进行后续还原反应时对于反应条件要求较为苛刻。由于上述副产物不能得到有效利用，导致目标产物的收率较低，原子经济性差，同时这些副产物的回收处理也需要消耗一定的成本。

8、2017年在欧洲公开的专利ep334429中，是使用氯化亚砜在甲苯溶液生成酰氯，之后借助光学纯的脱氢枞胺与消旋的酰氯反应生成酰胺非对映体，再经过数次重结晶过程、分离及水解过程而得到光学纯的对映体。但酰胺的反应条件激烈，易发生消旋化，且脱氢枞胺价格高昂。

9、2018年，专利文献cn201810786677.0，涉及一种奈必洛尔中间体的α-卤代酮的制备方法，以及一种用于制备该α-卤代酮的中间体化合物的制备方法。以色满酸为原料，和双卤代物或者双磺酸酯反应，得到双色满酸酯。继而在有机锂作用下，和二卤代甲烷反应，得到奈必洛尔中间体α-卤代酮。克服了生产α-卤代酮的中间体成本高，纯度低的缺点。并且具有操作简单，对环境友好，便于工业化生产等优点。

10、2019年，专利cn110218718a，发现了固定化酮还原酶突变体作为催化剂，与辅酶再生体系共同用于制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物，反应转化率可达90％、95％或99％以上，但产物的手性纯度值仅在95％左右。

11、以上报道的方法虽然可以用于制备奈必洛尔，但是反应过程需要使用昂贵的试剂，成本较大，而且有产率低，产物纯度低等缺点，不利于实际工业中的生产应用。

技术实现思路

1、本发明针对上述现有技术中存在的问题，提供了一种奈必洛尔中间体neb-8(r,s)的制备方法，该方法采用一种新的酮还原酶高对映选择性催化产生neb-8(r,s)，是高手性纯度，高产率，低成本，反应条件温和的酶催化制备方法。

2、本发明的第一个目的是提供氨基酸序列如seq id no.1所示的酮还原酶在制备氧化剂或还原剂中的应用。

3、进一步地，底物包括醇或酮。

4、进一步地，所述醇包括乙醇、异丙醇、叔丁醇、环醇、1-辛醇中的一种或几种；所述酮包括丙酮、3,4-己二酮、苯乙酮、4-羟基苯乙酮、苯甲酰乙酸乙酯、2-羰基-4-苯基丁酸乙酯、neb-7s中的一种或几种。

5、进一步地，还原ph为6.0-8.0；氧化ph为7.0-10.0。

6、本发明的第二个目的是提供一种生产neb-8(r,s)的方法，包括以下步骤：以neb-7s为底物，以氨基酸序列如seq id no.1所示的酮还原酶或含有该酮还原酶的表达系统为催化剂，将底物经不对称还原反应转化为neb-8(r,s)。反应路线如下：

7、

8、进一步地，所述酮还原酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。

9、本发明通过大量的研究最终筛选到的上述具有如seq id no.1所示的氨基酸序列的酮还原酶，能够有效地将底物转化成手性产物，手性纯度能够达到99％以上，同时也能够保证产物的收率。也就是说，本发明开发提供了一种新的生物催化的酶催化剂，从而能够有效提供一种新的酶催化合成工艺，本发明的具有seq id no.1所示的氨基酸序列的酮还原酶mradh可能是来源于modestobacter roseus，这也为提供酮基转化成高手性的羟基提供更好的酮还原酶的可选择性，有利于工业化的生产需求。

10、进一步地，所述酮还原酶的用量为5-10g/l，neb-7s的浓度为0.2-1.0m。所述的酮还原酶mradh为neb-7s质量的2.5％-12.5％。

11、进一步地，所述的neb-7s的载量为20-150g/l。

12、进一步地，反应体系中含有辅酶及辅酶再生系统，所述辅酶再生系统中含有异丙醇。具体地，在磷酸盐缓冲液中，在所述的酮还原酶的催化下，由于mradh对异丙醇的氧化活力相对较高，本发明利用酮还原酶对异丙醇的氧化实现辅酶再生，利用neb-7s进行不对称还原反应形成光学活性neb-8(r,s)，然后采用常规化工分离方法，从反应液中提取、精制反应生成的光学纯手性neb-8(r,s)的应用。

13、进一步地，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸-磷酸钠缓冲液。

14、进一步地，反应温度为20-80℃。

15、进一步地，反应体系中含有金属离子，如锌离子，浓度为0.01-0.5mm。

16、进一步地，含有酮还原酶的表达系统包括表达所述酮还原酶的宿主细胞。

17、进一步地，所述宿主细胞包括细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。优选为由t7启动子调控mradh表达的重组大肠杆菌，酮还原酶通过该重组大肠杆菌发酵培养得到，后添加至酶催化反应体系中。

18、进一步地，所述酮还原酶的制备方法包括以下步骤：将含表达载体及酮还原酶的大肠杆菌接入2×lb培养基中，37℃培养至od600＝2，加入终浓度为0.2mm的iptg，继续控制温度在16℃，培养结束后得到相应的发酵液，离心收集菌体。

19、进一步地，加入了助溶剂乙醇。

20、本发明的有益效果：

21、本发明的酮还原酶可以氧化异丙醇实现辅酶循环再生，还原neb-7s，合成高对映选择性neb-8(r,s)，使转化率在11h达到99％以上，并能实现高达150g·l-1的克级制备，催化剂载量为12.5％。终产物neb-8(r,s)的e.e.值高达99.9％。