用于从冻存PBMC获得T细胞的培养物组合及培养方法与流程

本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及用于从冻存pbmc获得t细胞的培养物组合及培养方法。

背景技术：

1、细胞治疗作为当前肿瘤治疗较为火热的研究领域之一，以car-t(chimericantigen receptor t cell)研究最为成熟。2017年全球首款car-t产品kymriah获得fda批准上市，用于治疗儿童和年轻成年患者急性淋巴细胞性白血病(all)，到目前为止，已有多款靶向cd19或bcma的car-t产品获批上市。

2、car-t的制备包括单采血细胞pbmc分离、t细胞分选、t细胞激活、基因转导和细胞扩增制剂。当前car-t制备大多起始原材料为新鲜的pbmc，患者单采后通过冷链运输至制备工厂，一般要求运输至生产时限控制在48h以内，大大限制了car-t制备的广度，增加了工厂制备的产能压力，也不利于跨区域的细胞制备和运输，而使用冻存pbmc作为起始生产原材料，既能克服细胞运输时限，又能解决工厂制备产能的压力，便于工厂灵活制定生产计划。

3、使用冻存pbmc首先需要复苏细胞，目前主要采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。这样冻存复苏过后的细胞，虽在形态上无明显差异，但会因冻存液的成分和冻存时间的影响，在数量上有较大的损失，多达50％的细胞可能在解冻后的第一个24小时内死亡。一些研究表明，这些死亡与细胞凋亡相关，部分凋亡相关蛋白的激活在冻融过程中被诱导。细胞凋亡包括外在途径、内在途径以及内质网应激所导致的凋亡，涉及多条信号通路。

4、基于上述原因，本发明现提供一种使用冻存pbmc培养t细胞的培养物组合及培养方法，所述方法在冻存pbmc复苏后，经过激活处理，细胞扩增效率显著提升，且cd3+干性细胞占比也有升高，因此增加了最终获得的t细胞数量。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种使用冻存pbmc培养t细胞的培养物组合，通过添加所述培养物组合，显著提升了细胞的扩增效率。

2、具体方案涉及一种使用冻存pbmc培养t细胞的培养物组合，所述组合包括凋亡蛋白抑制剂和胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(its-g)中的一种或多种。

3、细胞凋亡包括外在途径、内在途径以及内质网应激所导致的凋亡，涉及多条信号通路。凋亡蛋白抑制剂即用于抑制凋亡相关蛋白被诱导激活的物质，通过多种信号通路，抑制细胞凋亡。如作用于p-jak2，p-stat3，caspase-3，bax，rock中的一种或多种。

4、在具体的实施方式中，凋亡蛋白抑制剂选自山奈酚-3-o-芸香糖苷、ac-devd-cho、revitacell中的一种或多种。优选为山奈酚-3-o-芸香糖。

5、山奈酚-3-o-芸香糖苷[kaempferol-3-o-rutinoside(ka)]是一种从红花中提取的黄酮类化合物，可以改变受损神经元的形状和结构，减少凋亡细胞的数量，下调凋亡相关蛋白p-jak2,p-stat3,caspase-3和bax的表达，降低bax的免疫活性，增加bcl-2蛋白表达和免疫反应性。

6、ac-devd-cho(ac)是caspase-3的有效抑制剂，caspase3属于下游的效应组caspase(包括caspase-3，-6，-7)，效应caspase通过对细胞内蛋白特定的天冬氨酸残基位置处进行切割实现细胞的凋亡。

7、revitacell(re)补充剂含有高特异性的rock抑制剂，rock是一种丝氨酸/氨酸蛋白激酶，是目前功能研究最为详细的rho下游靶效应分子，与凋亡相关蛋白akt，bax，bcl2作用，参与细胞凋亡和存活。

8、its-g即胰岛素-转铁蛋白-硒，常作为基础培养基补充剂使用，以减少培养细胞所需的胎牛血清(fbs)的量。胰岛素可促进葡萄糖和氨基酸摄取、脂肪形成、细胞内运输以及蛋白和核酸的合成。转铁蛋白是铁载体，也有助于降低氧自由基和过氧化物的毒性水平。硒(以亚硒酸钠提供)是谷胱甘肽过氧化物酶和其他蛋白的一种辅因子，在培养基中用作抗氧化剂。

9、在一些优选的实施例中，所述组合为山奈酚-3-o-芸香糖苷和its-g。

10、其中，山奈酚-3-o-芸香糖苷浓度为10μg/ml-100μg/ml，优选为50μg/ml-100μg/ml。

11、本发明的另一个目的是提供基于上述培养物组合的培养方法，所述方法可以提高以冻存pbmc为原料制备t细胞的扩增效率，能够更好的满足car-t制备需求。

12、所述方法包括如下步骤：1)复苏冻存的pbmc；2)将复苏后的pbmc进行细胞分选；3)将分选出的t细胞进行活化培养，培养步骤加入上述的培养物组合。

13、在一些具体的实施方式中，在分选之前用含有dna酶的培养基孵育复苏后的pbmc，优选地，所述dna酶为脱氧核糖核酸酶i。

14、所述分选步骤采用cd4和cd8磁珠进行分选。

15、在一些具体的实施方式中，步骤3)所述的活化培养步骤包括：

16、(1)使用含有凋亡蛋白抑制剂和/或胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、以及激活剂的培养基进行孵育；

17、(2)使用含有胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂的培养基继续孵育步骤(1)获得的细胞。

18、在更具体的实施方式中，①所述凋亡蛋白抑制剂选自山奈酚-3-o-芸香糖苷、revitacell、ac-devd-cho中的一种或多种，例如为山奈酚-3-o-芸香糖苷、revitacell、或者山奈酚-3-o-芸香糖苷、revitacell、ac-devd-cho的组合；优选地，所述山奈酚-3-o-芸香糖苷的浓度为10μg/ml-100μg/ml，优选为50μg/ml-100μg/ml；ac-devd-cho的浓度为10-100μm，优选为40-60μm，revitacell的稀释倍数为50-250倍，优先为100-200倍；

19、②所述激活剂选自下组中任一组：cd3抗体，cd3抗体和cd28抗体，cd3抗体和4-1bb抗体，以及cd3抗体和4-1bbl抗原，优选为cd3抗体和cd28抗体，更优选为固定在载体上的cd3抗体和cd28抗体，进一步优选为transact cd3/28磁珠；

20、③步骤(1)和/或步骤(2)中的培养基为含有或不含血清或其替代物的aim-v培养基；优选地，所述培养基中还含有细胞因子，例如il-7和/或il-15；

21、④步骤(1)中孵育的时间不大于48小时，优选为48小时；

22、⑤步骤(1)中孵育条件为温度36℃～38℃，co2浓度4.8％～5.2％；

23、⑥步骤(2)中孵育前细胞密度为5×105/ml～1×106/ml。

24、发明同时提供通过上述方法获得的t细胞。

25、同时提供一种制备工程化t细胞的方法，包括将核酸转染至上述的t细胞中。

26、在一些实施方案中，所述核酸含有多肽编码序列，优选含有car的编码序列。

27、本文中，car是嵌合抗原受体，其结构包括：胞外区、铰链区、跨膜区和胞内区。car的n段还可具有信号肽。胞内区包括胞内共刺激域和胞内信号域。car还可以具有本领域已知的任何可与car序列相连的结构。

28、本发明的有益效果在于：

29、冻存的pbmc经复苏后，在培养过程中加入凋亡蛋白抑制剂和its-g，可以有效减少细胞凋亡，增加细胞活力，从而提高细胞扩增的效率，其中，以山奈酚-3-o-芸香糖苷的作用效果最优，其在t细胞扩增阶段，可以将扩增效率提高56％，而特定浓度的山奈酚-3-o-芸香糖苷还可以在一定程度上提高cd3+干性细胞(tn+tcm)的占比，使冻存pbmc复苏得率更高。

30、此外，本发明提供的基于培养物组合的培养方法，涉及的细胞数量、培养时间、培养温度、co2浓度，培养基添加物等，都有助于经冻存的pbmc培养复苏后培养t细胞。