靶向Claudin18.2的CAR-T细胞及其用途的制作方法

：本发明属于生物技术研发领域，具体提供了一种靶向claudin18.2的car-t细胞及其用途。

背景技术

0、
背景技术：

1、胃肠道肿瘤是全球癌症相关死亡率的第二大原因，手术和化疗是常见的胃肠道肿瘤治疗方法，对于早期癌症患者，手术切除仍然是主要的治疗选择；对于晚期转移的患者或无法手术切除的患者，化疗是最不可缺少的治疗方法。然而，癌症患者的化疗耐药性及肿瘤进展和复发已成为治疗失败的最主要原因，在过去的十年中，肿瘤生物学、肿瘤免疫治疗和靶向治疗的研究取得了显着进展，彻底改变了癌症的传统治疗方式，分子靶向药物在肿瘤治疗中表现出一定的优势。

2、在靶向治疗中，寻找合适的治疗靶点成为最重要的任务，近年来通过在her2和pd-l1中引入特定生物标志物靶向药物，取得了一定的治疗效果，但事实上，只有15-20％的患者可能从曲妥珠单抗中受益，并且只有pdl-1cps≥5的患者才能从纳武单抗中受益。因此，寻找新型抗肿瘤靶点成为研究的热点。

3、在众多候选靶点中，claudins(cldn)引起了研究人员的注意，它是一个多基因家族，cldn由四个跨膜结构域组成，包括细胞质中的n末端和c末端以及跨越跨膜结构域的两个细胞外环，它构成紧密连接的主要成分，紧密连接通常介导细胞间粘附并选择性地允许细胞间离子和小分子的旁细胞流动(参见singh p.,toom s.,huang y.anti-claudin18.2antibody as new targeted therapy for advanced gastriccancer.j.hematol.oncol.2017；10:105.doi:10.1186/s13045-017-0473-4)。claudins家族由24个成员组成，根据序列分析，这些蛋白质分为两个独立的组，称为经典cldn(1-10、14、15、17、19)和非经典cldn(11-13)、16、18、20-24，其中claudin-18是位于细胞膜表面的紧密连接的主要成分，它在维持细胞极性和屏障功能并促进耐酸性方面发挥着重要作用，在胃中，claudin-18通常形成针对h(+)的细胞旁屏障，促进酸性抵抗，并导致细胞旁h(+)渗漏、促炎细胞因子持续上调和小鼠萎缩性胃炎(参见hayashi d,tamura a,tanaka h,yamazaki y,watanabe s,suzuki k,et al..deficiency of claudin-18causesparacellular h+leakage,up-regulation of interleukin-1beta,and atrophicgastritis in mice.gastroenterology(2012)142:292–304)。人类claudin 18基因位点位于染色体3q22，分子量约为35kb，包含6个外显子和5个内含子。claudin 18的第一个外显子可以选择性剪接，形成两个具有高度同源氨基酸序列的不同剪接突变体(claudin 18.1和claudin 18.2)，跨膜蛋白claudin 18由两个细胞外环(ecl)、四个跨膜结构域和一个细胞质结构域组成。claudin 18的c端和n端均位于细胞质中，两种claudin 18蛋白亚型以组织特异性方式表达——claudin 18.1和claudin 18.2分别在正常胃和肺组织中特异性表达，claudin 18也在癌症组织中表达，并具有与肿瘤形成、增殖、侵袭和迁移相关的功能改变(参见hagen sj,ang lh,zheng y,karahan sn,wu j,wang ye,etal..loss of tightjunction protein claudin 18promotes progressive neoplasia development inmouse stomach.gastroenterology(2018)155:1852–67)。

4、长期以来，claudin 18.2已在各种实体瘤患者，特别是胃肠道癌症患者中得到广泛研究。claudin 18.2蛋白是一种高度选择性的胃谱系标记，在胰腺、食管、胆道、卵巢和肺肿瘤中检测到claudin 18.2频繁异位激活，而在胃癌和肉瘤组织中发现下调。值得注意的是，在胃癌恶变过程中，claudin 18.2表达降低，但仍保持稳定。此外，转移性病变(淋巴结和肝转移)中的claudin 18.2激活与原发性病变中的激活相当。这些发现具有重要意义，因为它们表明不仅患有局部晚期疾病的患者而且患有转移性癌症的患者都可能成为针对claudin 18.2的临床试验的候选患者群体(参见jinxia chen,zhiyuan xu,et al,targeting cldn18.2 in cancers of the gastrointestinal tract:new drugs and newindications,front oncol.2023；13:1132319)。

5、在针对claudin18.2的治疗领域，有许多药物处于临床开发阶段，包括单克隆抗体、car-t细胞、双特异性抗体和adc。其中，多项单克隆抗体疗法和car-t疗法的临床研究迄今已披露临床试验数据,后两种新兴药物类型adc和双特异性抗体近年来也已获批进行临床测试。与之前仅评估claudin 18.2靶向治疗在晚期胃癌和食管胃交界癌人群中的安全性和有效性的临床试验相比，最近批准的临床试验也扩大到包括其他晚期实体瘤患者，主要为消化系统肿瘤，包括胃癌、结直肠癌、肝内胆管癌和肝外胆管癌。

6、zolbetuximab(imab362)是一种嵌合igg1单克隆抗体，可与细胞表面的claudin18.2结合，随后通过抗体依赖性细胞毒性和补体依赖性细胞毒性过程诱导癌症死亡。ii期多中心mono研究评估了zolbetuximab单药治疗geac患者的二线和进一步治疗。纳入的患者在总肿瘤细胞中≥50％或更多具有中度至强claudin 18.2表达,在43名可获得抗肿瘤活性数据的患者群体中，治疗耐受性良好，总体缓解率(orr)为9％。在密蛋白高表达(≥70％)的患者中，orr为14％(参见tureci o.,sahin u.,et al.a multicentre,phase iia studyofzolbetuximab as a single agent in patients with recurrent or refractoryadvanced adenocarcinoma of the stomach or lower oesophagus:the monostudy.ann.oncol.2019；30:1487–1495)。ct041是第一个claudin 18.2-car-t细胞，在携带geac细胞系的小鼠和患者来源的肿瘤异种移植模型中显示出有希望的临床前肿瘤消退作用，一项i期临床试验的中期结果证实了ct041在37名接受过大量治疗的胃肠道癌症患者中的安全性可接受，在接受geac影响的28/37例患者中，orr和疾病控制率(dcr)分别达到57.1％和75.0％，6个月os率为81.2％(参见qi c.,gong j.,et al.claudin18.2-specificcar t cells in gastrointestinal cancers:phase 1trial interimresults.nat.med.2022；28:1189–1198)。

7、尽管已经开发出了多个针对claudin 18.2靶点的治疗药物，但仍面临有效性不强，安全性不高的困境，为此本发明提供了一种新型嵌合抗原受体，其能够靶向claudin18.2，有效治疗胃肠道肿瘤，且具有较高的安全性和有效性。·

技术实现思路

1、本发明中的第一方面提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受包括靶向claudin 18.2的抗原结合片段、铰链区、跨膜区、cd27胞内信号域、4-1bb胞内信号域和cd3ζ，所述靶向claudin 18.2的抗原结合片段具有纳米抗体结构，包括氨基酸序列如seq idno.1所示的可变区。

2、本发明提供的嵌合抗原受体以claudin 18.2为靶点，可特异性识别消化系统肿瘤，为实体肿瘤的治疗提供了新的研究思路。并且，本发明中识别claudin 18.2的抗原结合片段采用纳米抗体结构，这种抗原结合片段不仅体积小、结构简单，且能够与目标抗原高亲和力结合，适于制备和后续研发。

3、进一步的，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、进一步的，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如seq id no.3所示。

5、本发明中的第二方面提供了一种重组载体，包含所述编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列。

6、本发明中的第三方面提供了一种嵌合抗原受体t细胞，所述细胞膜表面表达所述的嵌合抗原受体。

7、本发明中的第四方面提供了一种药物组合物，包括所述的嵌合抗原受体t细胞和自噬抑制剂或自噬激活剂。

8、自噬调节剂在肿瘤的发生、发展和防治中具有重要作用，但是其作用机制复杂，作用效果也存在较多争议，本发明中在细胞水平和动物水平均予以尝试和验证，以便发现最优药物组合，从而提高肿瘤治疗的有效性，同时也为car-t临床治疗方案的开发和优化提供了建议。

9、进一步的，所述自噬抑制剂选自3-ma或羟氯喹。

10、进一步的，所述自噬激活剂选自雷帕霉素或阿霉素。

11、本发明中的第五方面提供了所述的嵌合抗原受体或所述的嵌合抗原受体t细胞或所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

12、进一步的，肿瘤为消化道肿瘤，包括食道癌、胃癌、结直肠癌。

13、有益效果

14、本发明提供了一种靶向claudin 18.2的嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)及其应用，具有以下优势：

15、(1)以claudin 18.2为靶点，使用具有纳米抗体结构的抗原结片段，简化了抗体结构，且能够与目标抗原高亲和力结合，提高了治疗靶向性，防止脱靶效应出现；

16、(2)采用第三代嵌合抗原受体结构，引入了cd27和4-1bb两个共刺激因子，提高抗肿瘤效果；

17、(3)将所述car-t细胞与自噬调节剂联用，揭示了抗肿瘤作用机理，为相关联合用药方案的开发提供方向；

18、(4)本发明提供的car-t细胞可有效调节炎症因子分泌，保持治疗的安全性。