Toll样受体激动剂及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，涉及一种toll样受体激动剂及其应用。

背景技术：

1、toll样受体(toll like receptors，tlrs)是在多种细胞类型中发现的高度保守的模式识别受体，在先天免疫细胞监视微生物病原体中起着关键作用。在人类中已经鉴定到10个tlrs，它们表达于t细胞、b细胞、apc以及多种非免疫细胞，包括上皮细胞和内皮细胞。tlrs定位在细胞的两个不同区域：细胞膜和细胞内小体。tlr1、2、5和6存在于质膜，tlr3、7、8和9表达于细胞内小体，tlr4在两个区域都存在。tlrs在肿瘤微环境表达于免疫细胞和肿瘤细胞，其激活可以抑制treg细胞功能，增强cd8+t细胞的存活、增殖和细胞因子释放。

2、迄今为止已有许多应用tlr激动剂治疗肿瘤的研究。由于tlr9的激活可引起树突状细胞、t细胞、b细胞活化，通过诱导干扰素-α分泌而促进t细胞向肿瘤微环境迁移，tlr9激动剂在肿瘤治疗领域显示出巨大的潜力。tlr9激动剂主要为细菌未甲基化的cpg dna，人工合成的cpg寡核苷酸(cpg oligonucleotide，cpg-odn)也已被证实可以有效激活tlr9。cpg-odn一般分为a、b、c三类：a类cpg-odn以含有cpg二核苷酸的回文序列为核心，两端为poly g尾，磷酸二酯键骨架为部分硫代修饰，通过回文序列和poly g形成高级结构，能够活化浆细胞样树突状细胞诱生大量i型干扰素，对b细胞活性弱；b类cpg-odn是一种全硫代修饰的线性cpg-odn，对b细胞有很强的免疫刺激活性，但不能活化浆细胞样树突状细胞；c类cpg-odn是一类全硫代修饰的cpg-odn，能通过回文序列形成二聚体，兼具a型和b型cpg-odn的活性，既能活化浆细胞样树突状细胞，又能活化b细胞。cpg-odn作为疫苗的辅助成分，用于增强免疫应答，目前已有产品被批准上市，如heplisav-b乙型肝炎疫苗。除了疫苗外，tlr9激动剂还可用于治疗炎症相关疾病和感染疾病等，目前都处于临床阶段。

3、尽管tlr9激动剂在肿瘤治疗上具有巨大潜力，但将其开发为抗肿瘤药物存在以下难点：1)tlr9激动剂全身性给药可引起全身性炎症，造成较大副作用，且仅有少量药物进入肿瘤微环境，效果较差；2)一些研究者使用瘤内注射方式给药，虽然一定程度减少了给药剂量，但药物扩散速度快，仅有很少药物可在瘤内滞留；3)tlr9属于胞内受体，裸cpg-odn仅有少量可以进入细胞并发挥作用。

4、目前tlr9激动剂主要从防止寡核苷酸被快速降解和增强内吞作用两方面进行优化。mologen ag公司的产品lefitolimod通过将线性寡核苷酸改造成哑铃状寡核苷酸，延长了寡核苷酸的体内半衰期，但是单药治疗一线治疗后的晚期结直肠癌和一线治疗后的小细胞肺癌的2期和3期临床试验结果不佳，疗效并不明显，所以目前没有正在进行的肿瘤临床试验。checkmate公司的瘤内注射产品cmp-001是一种cpg-a型的tlr9激动剂，通过病毒样颗粒包裹防止寡核苷酸被核酸酶降解，大大延长半衰期。但是采用病毒样颗粒装载递送寡核苷酸，其获取工艺繁琐，生产费用较高。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种toll样受体激动剂，具体地，提供一种tlr9激动剂，以解决上述技术问题中的至少一个。

2、本发明的第二个目的在于提供上述toll样受体激动剂的应用，具体地，提供上述toll样受体激动剂在制备疫苗佐剂或在制备治疗肿瘤的药物中的应用，以解决上述技术问题中的至少一个。

3、本发明的第三个目的在于提供一种递送系统，用于递送本发明提供的toll样受体激动剂，以解决上述技术问题中的至少一个。

4、本发明的第四个目的在于提供一种包含上述递送系统和药学上可接受的一种或多种辅料的药物组合物。

5、根据本发明的一个方面，提供了一种toll样受体激动剂，其核苷酸序列包括经修饰的或未经修饰的如seq id no:1～4所示的核苷酸序列中的任意一种。

6、在一些实施方式中，核苷酸的修饰为序列中所有的磷酸二酯键均采用硫代修饰。即，将序列中相邻的两个核苷酸之间的p＝o键替代为p＝s键。

7、本技术提供的toll样受体激动剂(下称为“cpg-odns”)为c类cpg-odn，可有效激活tlr9。

8、本发明提供的cpg-odns具有显著的抑制肿瘤生长的作用，可应用于制备治疗肿瘤的药物，制得的药物可通过瘤内给药或系统给药等途径给药，实现对肿瘤的治疗。

9、在一些实施方式中，可应用本发明提供的cpg-odns进行治疗的肿瘤包括但不限于以下肿瘤：结肠癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝癌、直肠癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、非黑色素瘤皮肤癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌。

10、本发明提供的cpg-odns还可应用于疫苗佐剂领域，用于增强免疫应答，提高抗体滴度。在一些实施方式中，cpg-odns可作为主要成分应用于制备疫苗佐剂，其中，cpg-odns可以以脂质偶联形式或直接包封形式存在于疫苗制剂中，或以游离形式直接存在于疫苗制剂中。

11、根据本发明的另一个方面，提供了一种递送系统，该递送系统可用于递送本发明提供的cpg-odns，其组分包括活性成分和脂质成分，其中，活性成分包括本发明提供的的cpg-odns，脂质成分的组成包括dotap(cas:132172-61-3，(2,3-dioleoyloxy-propyl)-trimethylammonium-chloride)、dodma(1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷，cas:104162-47-2)、dspc(二硬脂酰磷脂酰胆碱，cas:816-94-4)、胆固醇和peg脂质。

12、qtsome是一种四价(quaternary)和三价(tertiary)阳离子磷脂共存的脂质纳米粒，本发明采用qtsome脂质纳米技术包封cpg-odns，通过引入在特定条件可电离的阳离子脂质的组合，利用脂质体对外环境ph的敏感性，以最大化寡核苷酸负载并促进cpg-odns在细胞内递送。

13、本发明提供的具有特定脂质成分组成的递送系统可为cpg-odns提供稳定的包衣，能够保护cpg-odns免受体内酶系统的降解，提高cpg-odns的生物利用度，延长寡核苷酸的体内半衰期；同时，其还可提高药物粒径及细胞吸附，达到提高药物在瘤内的滞留的目的。利用本发明提供的递送系统，结合瘤内给药的方式，可以有效提高药物在瘤内的滞留并高效递送到肿瘤浸润免疫细胞，增强肿瘤组织免疫应答反应，提高肿瘤治疗效果。

14、在一些实施方式中，脂质成分与cpg-odn的质量比可以为(8～12):1。

15、在一些实施方式中，dotap、dodma、dspc、胆固醇和peg脂质的摩尔比可以为(1～30)：(5～50)：(5～40)：(15～60)：(0～10)。

16、在一些实施方式中，peg脂质可以选自dsg-peg、dmg-peg中的至少一种。

17、本发明还提供了一种制备上述递送系统的方法，包括如下步骤：

18、取cpg-odn用缓冲液配制成cpg-odn缓冲液；

19、取脂质成分用无水乙醇配制成脂质乙醇溶液；

20、取脂质乙醇溶液和cpg-odn缓冲液按脂质成分与sirna的质量比为(8～12):1混合，除去乙醇、稀释并调节ph为6.8～7.2，即得。

21、在一些实施方式中，本发明提供的cpg-odns还可以与其他现有的具有抗肿瘤活性的成分联合给药，以提高cpg-odns免疫激活效率及肿瘤抑制效果。

22、在一些实施方式中，具有抗肿瘤活性的成分可以选自除本发明提供的cpg-odns以外的现有的toll样受体激动剂、具有抗肿瘤作用的单克隆抗体、蒽环类化合物、喜树碱类化合物、免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death，icd)诱导剂、酪氨酸激酶抑制剂、紫杉醇类化合物中的至少一种。

23、在一些实施方式中，具有抗肿瘤作用的单克隆抗体包括但不限于：以pd-1为靶点的单克隆抗体，如纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、西米普利单抗、特瑞普利单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗等；以pd-l1为靶点的单克隆抗体，如阿特朱单抗、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗等；以ctla4为靶点的单克隆抗体，如伊匹单抗、替西木单抗等。本发明提供的cpg-odns与以pd-1/pd-l1为靶点的单克隆抗体药物联合用药，可有效增强免疫检查点抑制剂的反应性或克服免疫检查点抑制剂的抵抗性，有利于进一步扩大pd-1/pd-l1抑制剂的患者群体，提高药效，拓宽适应症。

24、在一些实施方式中，蒽环类化合物包括但不限于：多柔比星、表柔比星、吡柔比星、柔红霉素、阿柔比星、伊达比星、氨柔比星等。

25、在一些实施方式中，喜树碱类化合物包括但不限于：拓扑替康、伊立替康、贝洛替康、衣沙替康(dx-8951)、勒托替康(lurtotecan)、喜诺替康(sinotecan)、鲁比替康(rubitecan，9-nc)、9-氨基喜树碱(9-ac)、吉马替康(gimatecan)、karenitecin、db-67等。

26、在一些实施方式中，酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于：吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、阿法替尼、达可替尼、凡德他尼、来那替尼、pelitinib(ekb-569)、canertinib(ci-1033)、奥希替尼、rociletinib(co-1686，clovis oncology)、olmutinib(hm61713，韩美制药)、naquotinib(asp8273，安斯泰来)、tesevatinib(xl647/kd019，kadmon corporation)、nazartinib(egf816，诺华)和pf-06747775(辉瑞)等。

27、在一些实施方式中，免疫原性细胞死亡诱导剂包括但不限于：dna损伤剂、博来霉素等。

28、在一些实施方式中，紫杉醇类化合物包括但不限于：紫杉醇、多西他赛等。

29、在一些实施方式中，可以将resiquimod(一种tlr7/8激动剂，又称r848)与本发明提供的cpg-odns共包封为双活性成分脂质体(tritolimod)，由此，可进一步提升肿瘤微环境免疫应答，从而可有效提高肿瘤的治疗效果。

30、在一些实施方式中，resiquimod与cpg-odn的摩尔比为(0.1～5):1。

31、在一些实施方式中，可以将化疗药物盐酸多柔比星(doxorubicinhydrochloride，dox)与本发明提供的cpg-odns共包封为双活性成分脂质体(doxotolimod)，由此，通过多比柔星促进肿瘤抗原释放，可增强由cpg-odns活化的cd8+t细胞对肿瘤细胞的识别杀伤，从而有效提高肿瘤的治疗效果。

32、在一些实施方式中，多比柔星与cpg-odns的摩尔比为(0.1～5):1。

33、根据本发明的有一个方面，提供了一种药物组合物，包含本发明提供的含cpg-odns的递送系统和药学上可接受的一种或多种辅料。

34、本发明提供的含cpg-odns的递送系统，可有效抑制肿瘤的生长，可与药学上可接受的一种或多种辅料制成药物，应用于肿瘤的治疗。