一种大刺鳅性别鉴定的PCR引物以及鉴定方法与流程

本发明涉及生物检测，更具体的说是涉及一种大刺鳅性别鉴定的pcr引物以及鉴定方法。

背景技术：

1、大刺鳅(mastacembelus armatus)是我国南方地区的重要淡水鱼类，营养价值高，富含多种氨基酸、不饱和脂肪酸，具有较高的经济价值。近年来，我国大刺鳅野生资源急剧减少，目前，在福建龙岩、湖南资兴、广东增城等地设有大刺鳅国家级种质资源保护区，列为重点保护对象。近年来，在大刺鳅的人工养殖过程中发现存在生长速度的性别二态性，即雄鱼生长速度大于雌鱼，但是繁殖的鱼苗中雌鱼比例却占到了70～80％，所以开展大刺鳅的性别控制育种是一件很有现实意义的研究工作。随着分子生物学相关技术的发展，鱼类性别特异性标记的开发逐渐成熟，为鱼类的性别控制育种提供了基础，这对大刺鳅的全雄人工繁育产业发展提供了可能性。

2、基于性别特异性分子标记，可以简单快速地区分遗传性别。专利cn105368948a公开了一种尼罗罗非鱼性别pcr鉴定用引物及pcr鉴定方法，所述引物能够对尼罗罗非鱼的amh基因进行特异性扩增，雄性个体生成2条特异性扩增片段，长度分别为：179bp和412bp，雌性个体生成1条长度为412bp的特异性扩增片段。能够明显区分，因而可以简单、精确地对尼罗罗非鱼的性别进行鉴定。专利cn 112029843 a公开了一种鉴定金钱鱼遗传性别的特异性分子标记及其引物和应用。所述分子标记为两条在金钱鱼x染色体和y染色体中部分同源的dna片段，该发明从金钱鱼基因组信息中筛选到两条在金钱鱼x染色体和y染色体上部分同源dna片段，并设计特异性引物进行金钱鱼遗传性别鉴定，可以快速、准确地区分金钱鱼遗传性别。专利cn 112725427a公开了一种基于荧光pcr技术鉴定鲟鱼性别的引物、荧光探针及试剂盒，所述引物和荧光探针包括基于鲟鱼w染色体特异dna序列设计的引物wf、引物wr和荧光探针w以及基于鲟鱼z染色体特异dna序列设计的引物zf、引物zr和荧光探针z，所述试剂盒包括荧光pcr反应液、taqdna聚合酶、阴性对照和阳性对照，所述荧光pcr反应液包括上述引物和荧光探针；鲟鱼基因组样品在进行荧光pcr扩增后，进行ct值分析；若两组引物的荧光pcr结果均为阳性，则待测样品为雌性；若w染色体特异dna序列引物的荧光pcr结果为阴性而z染色体特异dna序列引物的荧光pcr结果为阳性时待测样品为雄性。专利cn109880893 b公开了用于丝尾鱯性别鉴定的特异性dna片段及应用，可以利用常规pcr扩增对丝尾鱯的性别进行鉴定。专利cn 111154852 b公开了大刺鳅性别鉴定的特异性dna片段及应用，可以利用常规pcr扩增和普通琼脂糖电泳对大刺鳅的性别进行鉴定。

3、上述现有技术均是基于不同鱼类的性别特异性分子标记以实现性别鉴定。然而针对大刺鳅的性别鉴定的pcr方法却鲜有报道，原因是：1、筛选符合要求的标记难：用高通量测序数据筛选y特异性别标记时，要求雄性样品测序reads完全覆盖标记而雌性样品完全没覆盖，因此比对时要选精细比对。2、保证引物的特异性难：引物设计时要考虑到引物特异性，因此设计引物后，要在基因组上进行引物特别性检测，保证该引物能特异扩增出y染色体序列和同源的x染色体区段，且保证扩增结果为清晰条带，无明显影响性别判断的杂带。

4、综上，如何提供一种大刺鳅性别鉴定方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种大刺鳅性别鉴定的pcr引物以及鉴定方法。为了得到高质量的大刺鳅dna性别特异性分子标记，本发明基于高通量测序数据分析结果筛选出的性别特异序列，设计性别特异引物，开发了大刺鳅雌雄之间有区别的pcr特征，表现为：雌性样品为单带，雄性样品为双带。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种大刺鳅性别鉴定的pcr引物，核苷酸序列如下：

4、dcq-f:acctccctggttcatgacag，seq id no.1；

5、dcq-r:gtcatggtgctaatattgtac，seq id no.2。

6、进一步的，所述引物能够对大刺鳅的性别特异序列进行扩增，雄性个体生成2条特异性扩增片段，雌性个体生成1条特异性扩增片段。

7、进一步的，雄性个体生成的2条特异性扩增片段长度分别为665bp和288bp，核苷酸序列如seq id no.3、seq id no.4所示；

8、雌性个体生成的1条特异性扩增片段长度为288bp，核苷酸序列如seq id no.4所示；

9、acctccctggttcatgacagatatacaacatttgtctctgataaatgttcatgtaggtatatgccataagccggccagtttcacaagcaaatcatttaaacatacttaaaagtacacttctttatcgttgtctatgtgcatatgtattttttttcccagttctttcaaccagtagtacatctgaagagctagtacaaccagtaaaatggacatttcagcttggcataaagtgataattaattccctgttactgacaagggttttctgtcatattatttttattacactcctgcaggttatgttttaaagattacaaacgatgtagtctgctctcccagtttaaataggctaaccctaatgtgccagtataatgggtaaaatggacttttcttcttgccaaaatgaaaaagtctttctgcctcagaatagctttatttagctcctgtgggttgtattttaaatattataaaacatcctgtcctttttatcactttaagtaactctaatagcccagtatagccagtaaagttaacttctctctttgccaaaatgtgattacagtcaataccttgttactcaatctttagcgtactgtgcatgctgctgaataccacagccagtttctagtggatgatcactctttggtacaatattagcaccatgac，seq idno.3；

10、acctccctggttcatgacagatatacaacatttgtctctgataaatgttcatgtaggtatatgccataagccggccagtttcacaagcaaatcatttaaacatacttaaaagtacacttctttatctaatagcccagtatagccagtaaagttaacttctctctttgccaaaatgtgattacagtcaataccttgttactcaatctttagcgtactgtgcatgctgctgaataccacagccagtttctagtggatgatcactctttggtacaatattagcaccatgac，seq idno.4。

11、一种大刺鳅性别鉴定的方法，以大刺鳅基因组dna为模板，采用上述引物进行pcr扩增，并根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。

12、进一步的，pcr扩增的反应体系为：2*taqmastermix 10μl、上下游引物各0.8μl、ddh2o 7.4μl和基因组dna 1μl。

13、进一步的，pcr扩增的反应程序为：预变性94℃、3min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min。

14、一种大刺鳅性别鉴定用试剂盒，包括上述的引物。

15、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：(1)不需要杀死鱼的情况下，取样微创甚至无创，只需要剪取一点鳍条就可以提取dna，鉴定大刺鳅的性别。(2)对dna质量要求不高。(3)对于没有性腺成熟的幼鱼可以提前鉴定出性别(理论上来说，幼苗只要能提dna就可以鉴别出来，但是实际中，鱼太小取样就会对鱼伤害大，所以一般情况下至少10cm以上，剪一点鳍条后对鱼创伤小才行)。(4)验证成本低，验证方法和条件为常规pcr，无需复杂手段。(5)结果判定简单明了，凝胶电泳显示雄为双带，雌为单带，无需内参或对照。