一种醋酸加尼瑞克的纯化方法与流程

本发明涉及药物，具体涉及一种醋酸加尼瑞克的纯化方法。

背景技术：

1、醋酸加尼瑞克，英文名ganirelixacetate，分子式为c80h113cln18o13·xc2h4o2，分子量为1570.32，是一种人工合成的与内源性促性腺激素释放激素类似的十肽化合物，可以竞争性拮抗促性腺激素释放激素受体，从而可逆性地抑制黄体生成素和促卵泡激素的分泌。此外本品也可以卵母细胞的成熟与分裂以及黄体化，因此对卵巢过度刺激症有很好的治疗效果。而且醋酸加尼瑞克具有治疗周期短、妊娠率高、副作用少等特点，使其在临床上比同类药物具有更大的应用价值，因此这是一种很有市场和前景的多肽药物。

2、其结构式如下：

3、

4、现有技术中的醋酸加尼瑞克制备纯化方法多存在着收率低、纯度低，以及工序复杂的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种醋酸加尼瑞克的制备纯化方法。在本发明中，对醋酸加尼瑞克粗肽采用一步反相制备纯液相进行纯化，再经过转盐、旋蒸、冻干得到纯度极高的精肽。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供一种醋酸加尼瑞克的纯化方法，该方法包括以下步骤：步骤(1)：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以碳酸氢铵水溶液为a1相，以乙腈为b相，梯度洗脱的反相制备液相方法分离纯化醋酸加尼瑞克粗肽；步骤(2)：然后采用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以乙酸铵和乙酸溶液分别为a2和a3相，以乙腈为b相，梯度洗脱的反相制备液相方法转盐，收集合格馏分冻干，得到醋酸加尼瑞克。

4、进一步的，该方法具体包括以下步骤：步骤(1)：以10μm的c18键合硅胶为固定相，流动相a1相为物质的量浓度为20mmol/l～80mmol/l的碳酸氢铵水溶液，b相为纯乙腈，洗脱梯度为75％a1+25％b变化至65％a1+35％b；步骤(2)：以10μm的c18键合硅胶为固定相，流动相a2相为10mmol/l～30mmol/l的乙酸铵水溶液，流动相a3相为体积分数范围是0.1％～0.3％的乙酸水溶液，b相为纯乙腈，95％a2+5％b等度洗脱后，流动相种类和梯度变换为95％a3+5％b进行梯度洗脱，梯度洗脱为95％a3+5％b变化至50％a3+50％b，收集合格馏分冻干，得到醋酸加尼瑞克。本发明中制备纯化流动相的选择是先通过流动相筛选实验实现的，尝试用各种盐体系进行制备纯化后比较其纯化效果，主要是比较杂质去除效果和收率，从而筛选出最适合的流动相。相对于本发明中的流动相，相比于其它的溶剂系统对于粗肽中杂质尤其是消旋杂质的去除效果不如本发明中的流动相好。

5、其中，步骤(1)纯化中的洗脱梯度为60min内流动相由75％a1+25％b变化为65％a+35％b是通过大量的实验筛选得到的最优的洗脱条件，每6min变化1个乙腈梯度更加有利于靠近目的多肽主峰的小杂质的分离，尤其对消旋杂质的去除效果是非常的，而且可以通过延长出峰时间来改善去除杂质的效果，因此最终确定本发明中的洗脱梯度。

6、步骤(2)转盐：洗脱梯度为30min内由75％a3+25％b变化至65％a3+35％b，即每3min变化1个乙腈梯度可以有效的去除一些微小前杂，因为转盐也有一定的除杂效果，采用梯度洗脱比等度洗脱更为恰当，特别是那种一步纯化后纯度只有略大于95％时，一般情况下是重新进入第一步纯化进行再回收，这种情况下会造成样品损失较大，特别是当样品量很少但又比较珍贵的时候，为了有效地解决这种情况，本发明建议可以先直接进入梯度转盐可以除去一些小杂质得到纯度高的精肽。

7、进一步的，步骤(1)中梯度洗脱具体为：采用96％a1+4％b流动相平衡5min后上样，上样后梯度变为95％a1+5％b，梯度洗脱为5min内95％a1+5％b变化至75％a1+25％b，而后梯度洗脱为60min内由75％a1+25％b变化至65％a1+35％b，完成对样品的洗脱后，洗脱梯度5min内由65％a1+35％b变化为50％a1+50％b，最后经过5min流动相梯度回到96％a1+4％b，完成对色谱柱的冲洗。

8、进一步的，步骤(2)中梯度的洗脱具体为：采用95％a2+5％b流动相平衡5min后上样，而后流动相梯度为95％a2+5％b等度洗脱25min后，流动相种类和梯度变换为95％a3+5％b进行等度洗脱10min后，梯度洗脱为5min内梯度洗脱由95％a3+5％b变化至75％a3+25％b，然后梯度洗脱为30min内由75％a3+25％b变化至65％a3+35％b，完成对样品的洗脱和转盐后，流动相梯度5min由65％a3+35％b变化为50％a3+50％b，而后流动相梯度5min内保持50％a3+50％b不变，最后经过5min流动相梯度回到95％a2+5％b，完成对色谱柱的冲洗。

9、进一步的，所述流动相a1相为物质的量浓度为50mmol/l的碳酸氢铵水溶液。选择碳酸氢铵的盐溶液的依据是其对于醋酸加尼瑞克消旋杂质的分离效果最好，采用别的盐体系达不到这种效果，而对于化学合成多肽来说，消旋杂质是最难去除的杂质。流动相a中碳酸氢铵物质的量浓度为20mmol/l～80mmol/l不仅使得流动相有足够的缓冲能力和离子化强度，而且还有很好的纯化效果，同时可以有效避免多肽在高盐浓度下会析出的问题。如果碳酸氢铵物质的量浓度低于20mmol/l，不仅使得流动相的缓冲能力会显著下降，而且其离子化强度较低，这些都有可能导致洗脱过程中色谱峰拖尾或纯化效果不佳；如果碳酸氢铵物质的量浓度高于80mmol/l，则过高盐浓度可能导致多肽盐析堵塞色谱柱，不仅降低纯化效果，还增加了无谓的物料成本和损坏色谱柱。优选浓度是50mmol/l将各优点结合起来找到的平衡点浓度，在该浓度下既能保证好的纯化效果，又能保证肽的物化性质稳定，减少物料成本。

10、进一步的，所述流动相a2相为15mmol/l的乙酸铵水溶液。本发明中优选的浓度是15mmol/l，如果乙酸铵浓度过低，则有可能铵根离子不能完全置换掉多肽上的三氟乙酸根离子，导致三氟乙酸根离子残留，即转盐不完全而残留三氟乙酸盐，如果如果乙酸铵浓度过高，则有可能造成最终精肽中铵根离子残留超标，对最终产品残留离子的控制限度有影响。

11、进一步的，所述流动相a3相为体积分数范围是0.2％的乙酸水溶液。本发明中优选的浓度是0.2％，转盐的原理是先用一定浓度的相应盐型的铵盐水溶液先等度冲洗20min左右，即需要转成乙酸盐，就先用乙酸铵水溶液等度洗脱足够时间，因为铵根离子和三氟乙酸根离子的结合能力大于多肽与三氟乙酸根离子的结合能力，等到铵根离子完全置换掉多肽上的三氟乙酸根离子后，再用一定浓度的乙酸水溶液，梯度洗脱除色谱柱上的多肽，即完成了把三氟乙酸盐转成乙酸盐的过程。此过程如果乙酸浓度过低，则有可能转盐不完全或者梯度洗脱效果不佳，如果如果乙酸浓度过高，一般大多数高浓度的醋酸盐的多肽都不太稳定，而且还有可能造成最终精肽中乙酸根离子和乙酸残留超标，对最终产品残留离子和残留溶剂的控制限度有影响。

12、相较于现有技术，本发明提供的技术方案至少具有以下优点：

13、(1)本发明中流动相a1选择碳酸氢铵的盐溶液的依据是其对于醋酸加尼瑞克消旋杂质的分离效果最好，采用别的盐体系达不到这种效果，而对于化学合成多肽来说，消旋杂质是最难去除的杂质。流动相a1中碳酸氢铵物质的量浓度为50mmol/l不仅使得流动相有足够的缓冲能力和离子化强度，而且还有很好的纯化效果，同时可以有效避免多肽在高盐浓度下会析出的问题。优选浓度是50mmol/l将各优点结合起来找到的平衡点浓度，在该浓度下既能保证好的纯化效果，又能保证肽的物化性质稳定，减少物料成本。

14、(2)本发明中流动相a2优选的浓度是15mmol/l，如果乙酸铵浓度过低，则有可能铵根离子不能完全置换掉多肽上的三氟乙酸根离子，导致三氟乙酸根离子残留，即转盐不完全而残留三氟乙酸盐，如果如果乙酸铵浓度过高，则有可能造成最终精肽中铵根离子残留超标，对最终产品残留离子的控制限度有影响。

15、(3)本发明中优选的浓度是0.2％，转盐的原理是先用一定浓度的相应盐型的铵盐水溶液先等度冲洗20min左右，即需要转成乙酸盐，此过程如果乙酸浓度过低，则有可能转盐不完全或者梯度洗脱效果不佳，如果如果乙酸浓度过高，一般大多数高浓度的醋酸盐的多肽都不太稳定，而且还有可能造成最终精肽中乙酸根离子和乙酸残留超标，对最终产品残留离子和残留溶剂的控制限度有影响。