抗CK-MM抗体或其功能性片段及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及抗ck-mm抗体或其功能性片段及其应用。

背景技术：

1、急性心肌梗死(ami)是世界上最常见的死亡原因之一。因胸痛而到急诊室就医的患者中，有大约10％的病人会被确诊为心脏病发作。(does the patient with chest painhave a coronary heart disease？diagnostic value of single symptoms and signs--a meta-analysis.croat med j.2012 oct；53(5):432-41.)。对胸痛患者进行全面风险评估以消除不良结果对于降低发病率和死亡率，提高患者的生活质量，并减少国家卫生支出有重要意义。急性心肌梗死可能由心脏缺血性疾病和冠状动脉疾病导致。当动脉粥样硬化板破裂碎片或者血栓因为部分或者全部阻挡了冠状动脉而导致心脏的供血受限制时，心肌梗死的状况便会出现。由欧洲心脏病学会(esc)和美国心脏病学会(acc)制定了对急性心肌梗死的诊断标准。(thygesen k,alpert js,jaffe as,et al.fourth universaldefinition of myocardial infarction.eur heart j.2018)。相应的，病人确诊心肌梗死需要满足如下状况中的两项，典型的胸痛症状，特征性心肌标志物(如ck-mb同工酶，ctni或ctnt)的升高或降低，典型的心电图变化。

2、肌酸激酶(creatine kinase，简写为ck)以多种形式存在于动物体的体液和组织中，这些形式包括称为ck-mm，ck-bb，ck-mb的不同同工酶，以及线粒体ck和一些半衰期很短的ck-mm和ck-mb变体。已经知道这些每种形式的肌酸激酶都包括2种ck亚基，即b亚基和m亚基。目前认为循环的ck-mb含量水平是比较可靠的心肌损伤指示因子。当富含ck-mb的心肌细胞出现坏死时，血液循环中的ck-mb含量就会随之升高。

3、当患者面对会威胁生命的急性心肌梗死(ami)时，能够准确又迅速地提供ck-mb检测结果，对于立刻开展治疗就显得至关重要。据估计，要在急性心肌梗死的早期做出诊断，需要准确地检测到血液中1-2ng/ml的ck-mb浓度升高。通常情况下，当针对ck-mb的检测方法的分析灵敏度提高到足够检测这样低水平的ck-mb升高时，该方法的检测特异性往往会降低，这是因为ck-mb之外的ck同工酶的干扰，或者其它非特异性的作用效果。由于对低水平升高的循环ck-mb测量的不准确性的存在，因此检测试剂的检测特异性和灵敏度的极限直接决定了能否实现对急性心肌梗死的准确诊断。

4、目前市面上有基于不同检测方法学的多种试剂盒用于ck-mb的检测。包括：化学发光法(磁微粒化学发光法或毛细管化学发光免疫法等)，免疫层析法(基于量子点，免疫荧光等)，免疫抑制法等，但能用于ck-mb准确定量检测的优质抗体较少。

技术实现思路

1、本发明发现在实际检测中对于ck-mb的干扰ck-bb可以忽略不计，但ck-mm的干扰会直接导致检测结果的不准确，所以本发明的目的在于提供抗ck-mm抗体或其功能性片段，其能够高特异性的结合ck-mm，使得ck-mm失去活性，从而避免ck-mm对ck-mb检测的干扰，实现对ck-mb的准确定量，并最终应用到能够快速、准确检测ck-mb的免疫检测产品中。

2、具体如下：

3、所述抗ck-mm抗体或其功能性片段具有如下互补决定区：

4、cdr-vh1：s-x1-y-x2-w-n，其中x1是k或者d，x2是g；

5、cdr-vh2：y-i-s-x1-s-g-s-t-r-x2-n-p-s-x3-i-s，其中x1是f或y，x2是p或y，x3是s或l；

6、cdr-vh3：n-y-y-g-x1-s-h-g-x2-a-l-d-y，其中x1是g或n，x2是y或q；

7、cdr-vl1：k-s-s-q-s-x1-l-n-s-g-n-q-y-x2-y-l-a，其中x1是i或l，x2是n或g；

8、cdr-vl2：g-a-x1-t-r-x2-s，其中x1是l或s，x2是d或e；

9、cdr-vl3：q-n-x1-h-s-x2-p-v-t，其中x1是v或d，x2是e或y。

10、进一步地，所述互补决定区的cdr-vh1的x2是g，cdr-vh2的x1是y，cdr-vh3的x2是y，cdr-vl1的x1是l，cdr-vl2的x2是e，cdr-vl3的x1是d。

11、本发明所述cdr区段划分采用kabat算法。

12、“cdr”在本文中用于指抗体可变序列内的“互补决定区”。重链和轻链的可变区各有3个cdr，从重链或轻链的n端开始。

13、抗原结合位点可以包括六个cdr(本发明中的cdr-vh1、cdr-vh2、cdr-vh3、cdr-vl1、cdr-vl2和cdr-vl3)。包含单个cdr(例如cdr-vh1、cdr-vh2、cdr-vh3、cdr-vl1、cdr-vl2和cdr-vl3)的多肽可称为“分子识别单元”。抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明cdr的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链cdr3。因此，分子识别单元可能主要负责抗原结合位点的特异性。一般而言，cdr残基直接且最实质性地参与影响抗原结合。

14、在可选的实施例中，所述cdr-vh1中x1是k；

15、在可选的实施例中，所述cdr-vh1中x1是d；

16、在可选的实施例中，所述cdr-vh1中x2是g；

17、在可选的实施例中，所述cdr-vh2中x1是f；

18、在可选的实施例中，所述cdr-vh2中x1是y；

19、在可选的实施例中，所述cdr-vh2中x2是p；

20、在可选的实施例中，所述cdr-vh2中x2是y；

21、在可选的实施例中，所述cdr-vh2中x3是s；

22、在可选的实施例中，所述cdr-vh2中x3是l；

23、在可选的实施例中，所述cdr-vh3中x1是g；

24、在可选的实施例中，所述cdr-vh3中x1是n；

25、在可选的实施例中，所述cdr-vh3中x2是y；

26、在可选的实施例中，所述cdr-vh3中x2是q；

27、在可选的实施例中，所述cdr-vl1中x1是i；

28、在可选的实施例中，所述cdr-vl1中x1是l；

29、在可选的实施例中，所述cdr-vl1中x2是n；

30、在可选的实施例中，所述cdr-vl1中x2是g；

31、在可选的实施例中，所述cdr-vl2中x1是l；

32、在可选的实施例中，所述cdr-vl2中x1是s；

33、在可选的实施例中，所述cdr-vl2中x2是d；

34、在可选的实施例中，所述cdr-vl2中x2是e；

35、在可选的实施例中，所述cdr-vl3中x1是v；

36、在可选的实施例中，所述cdr-vl3中x1是d；

37、在可选的实施例中，所述cdr-vl3中x2是e；

38、在可选的实施例中，所述cdr-vl3中x2是y。

39、进一步地，所述各互补决定区选自如下突变组合中任意一种：

40、

41、

42、进一步地，所述抗体包括轻链骨架区fr1-l、fr2-l、fr3-l及fr4-l和重链骨架区fr1-h、fr2-h、fr3-h及fr4-h；所述重链骨架区fr1-h、fr2-h、fr3-h及fr4-h依次选自seq idno:1-4；所述轻链骨架区fr1-l、fr2-l、fr3-l及fr4-l依次选自seq id no:5-8。

43、进一步地，所述抗体还包含恒定区。

44、优选的，所述恒定区选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige和igd中的任意一者的恒定区，优选的，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

45、优选的，所述功能性片段选自所述抗体的vhh、f(ab’)2、fab’、fab、fv和scfv中的任意一种。

46、另一方面，本发明公开了一种试剂盒，所述试剂盒含有所述ckmm-b抗体或其功能性片段。

47、另一方面，本发明公开了所述ckmm-b抗体或其功能性片段在免疫检测中的用途。

48、另一方面，本发明公开了所述抗ck-mm抗体或其功能性片段在ck-mb检测试剂盒中的抗干扰作用。

49、本发明所述的“抗干扰”是指，排除在ck-mb检测时ck-mm的干扰。

50、有益效果：

51、本发明公开的抗体，对天然ck-mb中m亚基有较好的结合特异性和亲和力，不与b亚基交叉，并在临床样本中ck-mb的升高有很好的检测效果，且本发明做了多个有效的突变，对于免疫检测提供了更多的选择。