一种利用纳豆芽孢杆菌发酵豆渣提取纳豆激酶的方法与流程

本发明涉及豆渣处理，尤其涉及一种利用纳豆芽孢杆菌发酵豆渣提取纳豆激酶的方法。

背景技术：

1、大豆渣是大豆食品在生产过程中产生的一种工业废料，具有高含水量、高纤维素、高蛋白、低脂肪以及富含矿物质元素等特点，但由于豆渣中所含的营养物质如蛋白质、纤维素等无法被动物直接消化吸收利用，因此需要通过微生物发酵来提高豆渣的营养价值。

2、对豆渣进行合理的开发利用，是一种废物利用、资源再生的过程。通过对豆渣进行发酵并与未发酵豆渣营养成本相比，发酵后的豆渣可溶性蛋白含量、还原糖含量、糖化酶活力、纤维素酶活力、蛋白酶活力等均随着发酵时间的延长而增加；对豆渣进行纤维素提取，可以获得大量清洁的纤维素，且原材料存量巨大，不愁原材料的来源；对豆渣进行膨化食品、烘焙食品等的制作，给人食用，可以为人体带来大量的蛋白质及粗纤维。

3、当前豆渣的发酵，目前发酵方式主要存在两种：第一，通过市场售卖的豆渣复合菌种发酵剂进行发酵，一般发酵时间在72小时左右，所发酵出来的豆渣散发淡淡的酸味，可保存1个月以上。将发酵出来的豆渣加入饲料，混合均匀，直接用于饲喂猪或鸡等畜禽；第二，向豆渣中拌入米糠、麦麸等低价值的农产品加工副品，使豆渣疏松，让有益细菌得以生长，有害细菌受抑制，以更好用于昆虫饲养行或用于田间肥料。前者虽然能通过发酵较大程度地释放豆渣中的营养，但是直接用于养猪，带来极大的风险，随着非洲猪瘟的蔓延，豆渣的喂猪也是风险性极高的传播途径之一，稍有不慎将给养猪行业带来不可预估的损失。后者通过为益生菌创造有利的生存环境，并利用谷物外表皮自带的天然有利菌株对豆渣进行发酵，其虽然可以优化豆渣因为水分高、粘度大的缺点，但其对发酵释放豆渣中的营养的帮助不大，大部分豆渣的营养还是难以被动物利用。

4、针对上述的技术缺陷，现提出一种解决方案。

技术实现思路

1、本发明的目的在于：通过纳豆芽孢杆菌的发酵可以对豆渣的营养成分进行分解，提高发酵底物的营养价值，同时纳豆芽孢杆菌属于豆渣的益生菌，通过加入纳豆芽孢杆菌，可以对豆渣中的有害细菌进行抑制，并进一步通过酶活力数值直观反应利用纳豆芽孢杆菌发酵豆渣提取纳豆激酶过程中的酶活力变化，从而确定最佳发酵因子。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种利用纳豆芽孢杆菌发酵豆渣提取纳豆激酶的方法，以下操作步骤：

3、s1：选取纳豆芽孢杆菌粉末，加入lb液体培养基中，在28-32℃环境下，培养13.5-14.5小时，取50ml培养液，加入450ml的无菌水，稀释10倍后摇晃均匀，采用接种环在lb固体培养基中划线，置于30℃中培养箱中培养14-16小时；

4、s2：观察培养基中单菌株，用接种环蘸取表面粘稠的单菌株，接种于lb液体培养基中，在28-32℃环境下，培养13.5-14.5小时，再接到lb固体培养基中进行培养14-16小时，进行单菌株筛选，如此反复，直到菌落性状稳定，无杂菌,得到纳豆芽孢杆菌菌株；

5、s3：将豆渣粉碎后混入麦麸，将豆渣和麦麸混合后加入锥形瓶中，置于高压灭菌锅中灭菌20-30min，然后向锥形瓶中加入去离子水，使得锥形瓶中发酵物的含水量达到60％，取纳豆芽孢杆菌菌株进行接种，接种量为5％-9％，发酵时间为30-40小时的环境中进行发酵；

6、s4：完成发酵后，向发酵瓶内加入生理盐水，充分震荡后使得生理盐水与发酵渣充分接触，将发酵瓶内的混合物稀释5倍，在4℃的冰箱中浸提10-12小时，取部分溶液，在3500r/min的，4℃，离心10min，取上清液待用；

7、s5：将上清液经过过滤后加入硫氨酸溶液沉淀，二次过滤得到沉淀物，将沉淀物放入冰箱内冷冻得到粗制冻干酶粉，取出粗制冻干酶粉放入38-45℃的水中进行水浴解冻去除沉淀物内的糖类，用缓冲液溶解后过滤得到粗酶液；

8、s6：取粗酶液测酶活性。

9、进一步的，所述s3中豆渣和麦麸的比例为5:2，接种量所带的水分扣除后使得锥形瓶中的含水量达到60％。

10、进一步的，测定粗酶液活性的具体方法如下：

11、sa:获取纳豆激酶样品：将粗酶液作为上样液进行阴离子交换柱层析，其中阴离子交换柱层析采用deae-sephadexa-50阴离子交换层析树脂为层析介质；上样结束后进行洗脱出峰前按每10min/管收集流出液，洗脱至流出液不出峰；合并含有纳豆激酶蛋白和酶活的流出液，超滤，滤液冻干，即为纳豆激酶样品，取适量的纳豆激酶样品加入无菌水稀释至0.5-0.6iu/ml；

12、sb：制备琼脂糖平板；

13、sc:获取纳豆激酶标准品：取纳豆激酶发酵干粉0.5g，加入到10ml离心管中，用5ml10.9％nacl溶解、混匀后放入4℃冰箱浸提4h以上，浸提结束后5500rpm离心10min，移取上清液至干净离心管中，得到纳豆激酶标准品；

14、sd：计算溶解圈面积：取纳豆激酶标准品用无菌生理盐水稀释成不同浓度的n份，分别取n份10ul纳豆激酶标准品点样于融化琼脂糖平板，于37℃保温18h后，测定血纤维蛋白平板上溶解圈的直径，取两次试验的平均直径计算溶解圈面积；

15、se：绘制标准曲线；

16、sg：取纳豆激酶样品点样于融化琼脂糖平板，于37℃保温18h后，测定血纤维蛋白平板上溶解圈的面积l，根据回归方程l＝pg+q(r2＝b)即可得到纳豆激酶样品的酶活力g。

17、进一步的，制备琼脂糖平板的具体方法如下：

18、s①：取1支纤维蛋白原，加入24.4ml0.01mpbs(ph7.4)溶液溶解；

19、s②：取适量的凝血酶用灭过菌的0.9％nac1溶液溶解至100bp/ml终浓度，取适量的1％琼脂糖用0.01m pbs(ph7.4)配置；

20、s③：取7.5mll％琼脂糖于无菌小瓶中，50℃保温10min后，加225u1100bp/ml凝血酶，混匀保温10min；

21、s④：取纤维蛋白原溶液7.5ml，缓慢加入含凝血酶的琼脂糖溶液中并不停摇动，将混匀的溶液倒入灭菌平板中，冷却得到琼脂糖平板。

22、进一步的，绘制标准曲线的具体方法如下：

23、sⅰ：以纳豆激酶标准品的酶活力(fu/ml)为横坐标xn，测定得到的血纤维蛋白平板上溶解圈面积(mm2)为纵坐标yn，得到纳豆激酶标准品的酶活力归集直线，将纳豆激酶标准品的测定溶解圈面积标记为i，i为正整数，且i的取值范围为1、2、3……n；

24、sⅱ：在标准品归集直线上对应每一xn的yn值，根据yn值得到新的xq，设定纳豆激酶标准品在酶活力检测过程中的误差参数ε，根据公式从而求出误差参数ε；

25、sⅲ：将纳豆激酶标准品的酶活力(fu/ml)xn和测定得到的血纤维蛋白平板上溶解圈面积(mm2)yn，根据误差参数ε进行去误差值处理，得到归集后的酶活力(fu/ml)l和溶解圈面积(mm2)g，其中l＝|xn-ε|，g＝|yn-ε|；

26、sⅳ：以l为横坐标，g为纵坐标绘制纳豆激酶标准品的标准曲线，根据标准曲线求得纳豆激酶标准品酶活力相关回归方程l＝pg+q(r2＝b)，根据标准曲线上的l和g数值，求得唯一的p和q值。

27、进一步的，在发酵过程中，发酵底物中豆渣和麦麸的比例为5:2时，发酵物的含水量达到60％的发酵条件下，根据酶活性测定结果判断发酵的最佳温度t、最佳接种量w和最佳发酵时间t，其具体过程如下：

28、设定最佳接种量w1、w2……wn，，取纳豆芽孢杆菌菌株进行接种，发酵温度为t，发酵时间为t小时的环境中进行发酵,完成发酵后，根据酶活性测定方法获得溶解圈面积(mm2)g1、g2……gn，将溶解圈面积数值带入l＝pg+q(r2＝b)后，获得对应的纳豆激酶标准品的酶活力数值，根据纳豆激酶标准品的酶活力的数值判断数值最大对应的接种量为最佳接种量w；

29、设定发酵温度t1、t2……tn，取纳豆芽孢杆菌菌株进行接种，接种量为w，发酵时间为t小时的环境中进行发酵,完成发酵后，根据酶活性测定方法获得溶解圈面积(mm2)g1、g2……gn，将溶解圈面积数值带入l＝pg+q(r2＝b)后，获得对应的纳豆激酶标准品的酶活力数值，根据纳豆激酶标准品的酶活力的数值判断数值最大对应的发酵温度为最佳发酵温度t；

30、设定发酵时间t1、t2……tn，取纳豆芽孢杆菌菌株进行接种，接种量为w，发酵温度为t的环境中进行发酵,完成发酵后，根据酶活性测定方法获得溶解圈面积(mm2)g1、g2……gn，将溶解圈面积数值带入l＝pg+q(r2＝b)后，获得对应的纳豆激酶标准品的酶活力数值，根据纳豆激酶标准品的酶活力的数值判断数值最大对应的发酵时间为最佳发酵时间t。

31、进一步的，在发酵过程中，发酵底物中豆渣和麦麸的比例为5:2时，发酵物的含水量达到60％的发酵条件下，最佳温度为33摄氏度，最佳接种量为9％，最佳发酵时间为35.5小时。

32、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

33、1、该利用纳豆芽孢杆菌发酵豆渣提取纳豆激酶的方法，通过纳豆芽孢杆菌可分泌蛋白酶、脂肪酶、谷氨酸转肽酶、植酸酶等多种蛋白酶，同时纳豆芽孢杆菌的芽孢结构的水分活度较低，因此纳豆芽孢杆菌的发酵可以对豆渣的营养成分进行分解，提高发酵底物的营养价值，同时纳豆芽孢杆菌属于豆渣的益生菌，通过加入纳豆芽孢杆菌，可以对豆渣中的有害细菌进行抑制。

34、2、该利用纳豆芽孢杆菌发酵豆渣提取纳豆激酶的方法，通过纳豆芽孢杆菌属于可降解植物性蛋白的细菌，可有效地对豆渣中的营养成分进行降解，纳豆芽孢杆菌发酵豆渣可产生纳豆激酶，纳豆激酶在治疗心脑血管方面可发挥较大的作用，具有溶血栓、降血压以及抗凝血等作用，具有较高的经济价值。

35、3、该利用纳豆芽孢杆菌发酵豆渣提取纳豆激酶的方法，通过制备琼脂糖平板，将纳豆激酶标准品点样于融化琼脂糖平板，测定血纤维蛋白平板上溶解圈的直径，得到纳豆激酶标准品的绘制标准曲线，并通过去误差值处理，得到归集后的纳豆激酶标准品的标准曲线，进而得到精准的酶活力数值，能够通过酶活力数值直观反应利用纳豆芽孢杆菌发酵豆渣提取纳豆激酶过程中的酶活力变化，从而确定最佳温度、最佳接种量和最佳发酵时间，进一步完善方法流程。