一种海南粗榧谷氨酸氨基转移酶AAT1及其应用

本发明属于植物基因工程，具体涉及一种海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1及其应用，尤其涉及一种海南粗榧三尖杉酸生物合成通路中l-亮氨酸或l-高亮氨酸脱氨生成α-酮酸的谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase 1，aat1)及其编码蛋白和应用。

背景技术：

1、三尖杉酯类生物碱是亚洲东部至南亚次大陆裸子植物三尖杉科三尖杉属植物中所特有的一类的生物碱，该类化合物是由母核结构三尖杉碱和酯侧链三尖杉酸两部分组成。经过动物实验和相关临床研究发现，三尖杉酯类生物碱中的三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱和脱氧三尖杉酯碱对淋巴细胞白血病l-1210和p388具有显著的抗肿瘤活性，但它们的母核结构三尖杉碱没有任何生物活性，这表明酯侧链是至关重要的(powellet al.，1972；mei，2006)。这4种三尖杉酯类生物碱中的高三尖杉酯碱和三尖杉酯碱在我国早已经投入临床使用且疗效显著(中国医学科院，1979)。自20世纪90年代至今，这两种三尖杉酯类生物碱就一直被录入《中国药典》中(中国药典，1990；中国药典，2005；中国药典，2015；中国药典，2020)。目前，高三尖杉酯碱也已经得到美国食品药品监督管理局(fda)的认可，成为国际公认的抗肿瘤药物(kantarjian et al.，2013)，被列入全世界36种抗癌药物之列。

2、海南粗榧是三尖杉科三尖杉属分布最南边的种，研究发现海南粗榧中是其所属科属中生物碱种类和抗肿瘤三尖杉酯类生物碱含量最多的品种，是三尖杉碱及其抗肿瘤酯类生物碱重要的天然植物来源。受限其来源单一且含量极低。如今，高三尖杉酯碱注射液在我国单价为15000元/g，而美国则为36000美金/疗程(abdelkafi et al.，2012；kantarjianet al.，2013)。

3、海南粗榧因自身生长缓慢，生境狭窄，随着过度开发利用，现如今已经被《中国珍稀植物红皮书》列为二级濒危珍稀药用植物。通过砍伐植物获得抗肿瘤药物已经难以持续性满足商业化应用的。化学合成因其合成步骤繁多，损耗较大，且三尖杉酯类生物碱具有高度复杂的手性中心结构而易受到空间位阻的影响导致其活性丧失，目前仅处于研究初期，尚未到达工业化生产的水平。因此，通过基因工程或细胞工程解决生产三尖杉酯类生物碱的原料来源已成为当前研究的重点，在满足临床研究和商业化应用的同时，也对这种植物本身的高度濒危和特有种群进行了保护。

4、放射性标记试验已探明，三尖杉酸生物合成通路的直接前体是l-高亮氨酸(由l-亮氨酸生物合成)，经过脱氨、羟醛缩合和一系列c+1反应就可以形成三尖杉酸。其中，氨基转移酶是三尖杉酸生物合成通路中负责第一步。但是，当前关于三尖杉酸合成通路中的功能基因从未有过任何报道，该基因及其编码的蛋白序列尚不清楚。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种海南粗榧三尖杉酸生物合成通路中第一步催化l-亮氨酸或l-高亮氨酸脱氨生成α-酮酸的谷氨酸氨基转移酶aat1及其编码蛋白和制备方法。

2、本发明的目的还在于提供一种包含上述海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1的重组表达载体、重组表达工程菌和重组海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1。

3、本发明的最后一个目的在于提供上述谷氨酸氨基转移酶aat1、编码的蛋白、包含所述谷氨酸氨基转移酶aat1的重组表达载体、重组表达工程菌以及重组海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1在调控海南粗榧三尖杉酸生物合成通路中l-亮氨酸或l-高亮氨酸脱氨生成α-酮酸中的应用。

4、本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1，其cds区核苷酸序列如seq id no：1所示。

5、本发明还提供了编码所述海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1的蛋白，其氨基酸序列如seq id no：2所示。

6、所述海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1的制备方法，包括以下步骤：将海南粗榧叶腋细胞的总rna反转录成cdna，以cdna为模板，用如seq id no：3和seq id no：4所示的引物对进行pcr扩增即得。

7、本发明致力于提供一种海南粗榧三尖杉酸生物合成通路中谷氨酸氨基转移酶aat1，提高催化生物合成通路中l-亮氨酸或l-高亮氨酸脱氨生成α-酮酸的效率，使合成三尖杉酯类生物碱过程的中间体α-酮酸、三尖杉酸以及最终产物三尖杉酯类生物碱的产量得到大幅度提高，显著降低抗肿瘤三尖杉酯类生物碱药物的生产成本，有效解决市场上三尖杉酯类生物碱价格昂贵、供不应求的现状。

8、本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种重组表达载体，包括上述的海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1和表达载体。

9、可选地，所述表达载体为pet28a。

10、作为本发明一种优选的实施方式，所述重组表达载体为pet28a-aat1。

11、本发明还提供了一种重组表达工程菌，将上述海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1构建到表达载体pet28a上，用所得重组表达载体转化表达菌株bl21(de3)plyss，利用抗生素平板筛选阳性菌株构建大肠杆菌工程菌，即得到重组表达工程菌。

12、本发明还提供了一种重组海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1，包括用上述的重组表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1。

13、可选地，所述寄主细胞为大肠杆菌。

14、此外，除了重组表达载体、重组表达工程菌和重组海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1之外，还可以是包括所述海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1基因的表达盒、转基因细胞系等。

15、本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1、编码的蛋白、重组表达载体、重组表达工程菌或重组海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1在调控海南粗榧三尖杉酸生物合成通路中l-亮氨酸或l-高亮氨酸脱氨生成α-酮酸中的应用。

16、可选地，所述α-酮酸为α-酮异己酸或α-酮异庚酸。

17、本发明可实现海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1、所述基因编码的蛋白、含有所述海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1的表达盒、重组表达载体、重组表达工程菌、重组海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat1等在调控海南粗榧谷氨酸氨基转移酶aat催化l-亮氨酸或l-高亮氨酸合成α-酮酸的应用之外，还可以在基因工程、细胞工程等生物合成技术中的应用。还可以利用将基因工程技术获得的改良植物(该改良植物中α-酮酸含量增加)在食品、保健品和生物医药领域中的应用。

18、本发明具有以下优点：本发明针对海南粗榧三尖杉酸生物合成通路中功能基因研究基础薄弱的现状，首次从海南粗榧中克隆得到催化l-亮氨酸或l-高亮氨酸脱氨后生成α-酮酸的谷氨酸氨基转移酶基因aat1，该基因aat1为海南粗榧三尖杉酸生物合成通路中第一步反应的关键基因，为今后利用基因工程或细胞工程技术获得具有抗癌活性的药物或食物提供了重要的理论依据，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。