人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系SPD01LM及构建方法与应用

本发明属于细胞系，具体涉及一种人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm及构建方法与应用。

背景技术：

1、胃癌在全球范围内是一种常见的恶性肿瘤，其作为世界范围内第三大癌性致死原因，尤其好发于包括中国在内的东亚诸国。95％胃癌病理学类型均为腺癌(gastriccancer,version 2.2022,nccn clinical practice guidelines in oncology)，并且由于起病初期缺乏特异性症状而难以发现，大量患者确诊时已为进展期，甚至丧失了手术治疗时机，因此胃癌表现出极差的预后。

2、由于胃的淋巴结引流涉及多个淋巴结站点，因此，胃癌表现出广泛的淋巴结转移特征。2020中国癌症患者生存质量白皮书调查的胃癌患者中，52.3％的患者发生过转移，其中淋巴结转移占比35％。肿瘤的免疫反应是肿瘤发生发展过程中的重要过程，肿瘤细胞逃脱机体免疫监控后，表现出更为恶性的生物学特征，进而促进肿瘤增殖、侵袭和转移。

3、因此，在胃癌的治疗过程中，出现淋巴结转移的患者，除手术切除原发病灶之外，药物治疗、放射治疗以及分子靶向治疗或者免疫治疗便成为重要的辅助治疗方式。但由于胃癌的高度异质性，不同患者对于药物辅助治疗的敏感性差异较大。同时由于转移灶和原发灶对于药物敏感性差异，临床辅助治疗过程中对于药物选择更加困难。

4、患者源性类器官已经被美国fda确立为是可以替代动物实验进行新药筛选或者药物敏感性实验的三维细胞培养模型。自国际上2009年成功构建出小鼠肠道类器官以来，类器官作为一种实验模型得到了广泛应用与发展。由于类器官在组织结构、细胞功能乃至基因谱上可以很好的重现其来源组织的多种特征，已经成为疾病发病机制研究、环境有害物相互作用研究以及药物敏感性研究的重要手段。

5、人们已经开发出了多种与胃癌相关的细胞系，并进行了相关医学研究。

6、如专利文献cn103387963b公开了一株ming氏人膨胀型胃癌细胞系，该细胞系能够连续传代，且细胞性状保持稳定，在裸鼠接种该细胞后全部成瘤，移植瘤组织学特性与原发瘤相似。然而，该细胞系不具备高糖基化特征，特别是并不具备广泛的敏感药物谱。

7、专利文献cn104403997b公开了一种具有顺铂耐药性的人胃癌细胞系，该人胃癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，成瘤率高，潜伏期短，均一性好，为胃癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。该人胃癌细胞系具有成瘤性，而且产生的肿瘤具有顺铂耐药性的特点。然而，该细胞系同样不具备高糖基化特征，而且并不具备广泛的敏感药物谱。

8、因此，能否获得一种遗传性稳定的体外培养的人源肿瘤类器官细胞系，以期具备较高的糖基化特征，特别是对于各类药物的耐药性和敏感性极佳，成为亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明就是为了解决上述技术问题，从而提供一种人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm及构建方法与应用。本发明的技术目的在于，提供一株能够稳定多代遗传，且具备高糖基化特征，特别是对于各类药物的敏感性极佳的人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系及其相关构建方法与应用。

2、本发明首先提供了一种人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系，所述细胞系命名为人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：c2023149。保藏时间为：2023年5月31日，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。

3、本发明还提供了上述人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系的子代细胞。

4、本发明进一步提供了一种构建上述人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm的方法，包括以下步骤：采集胃癌患者的病灶样本，可以是胃镜活检组织或者手术切除组织，经组织胶原酶进行消化、体外3d培养、类器官消化成细胞悬液扩增传代、筛选活力良好类器官，进行类器官的细胞鉴定，得到性能稳定的类器官细胞系。

5、本发明还提供了上述人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系在制备使裸鼠产生人胃低分化腺癌的试剂中的应用。上述应用中，所述裸鼠包括小鼠或大鼠。

6、本发明还提供了上述人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系在建立人胃低分化腺癌淋巴结转移动物模型中的应用。

7、本发明进一步提供了上述人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系在建立人胃腺癌发生、发展或转移的细胞模型中的应用。

8、本发明还提供了人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系在筛选防治人胃腺癌淋巴结转移药物中的应用。

9、本发明所构建的人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm体外传代性能稳定，体内具备成瘤能力，作为人胃腺癌转移机制以及靶向药物筛选等多方面具有广泛用途。

10、本发明提供的人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm及其子代细胞系具有下列生物学特征：

11、(1)将本发明中的spd01lm细胞系培养成功后，每10天进行传代，体外3d环境下连续培养45代，spd01lm细胞形态结构保持不变，确定获得性能稳定的人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系。

12、(2)本发明所构建的spd01lm细胞以6×103/孔的细胞密度接种于96孔板进行培养，其中spd01lm类器官细胞系的倍增时间为3天(72h)。

13、(3)spd01lm细胞免疫荧光染色，通过检测能反映胃上皮细胞来源的生物标志物muc5ac的表达，鉴定类器官系在体外长期传代中的表型稳定性。muc5ac检测结果显示，spd01lm对应的来源组织中muc5ac散在高表达，spd01lm体外培养45代仍表现广泛的muc5ac高表达。

14、(4)对spd01lm细胞凝集素染色，细胞糖基化是反映肿瘤细胞代谢功能状态指标之一。本发明采用接骨木凝集素(sambucus nigra lectin，sna)染色法检测人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系糖基化水平。表达检测结果表明：spd01lm对应的来源组织中sna散在阳性，spd01lm体外培养第45代仍表现广泛的sna染色阳性，且spd01lm凝集素sna染色阳性率63.6±8.88％，而常用淋巴结转移低分化腺癌细胞系hgc-27的sna染色阳性率仅为7.56±1.26％，表明本发明提供的细胞系spd01lm具有更高的sna糖基化阳性率。

15、(5)染色体核型分析，可以反映肿瘤类器官细胞系在基因组水平的变异状态。经过检测的染色体核型显示，spd01lm的核型为48,xx,+8,+12,r(21)(p13q22.3)。

16、(6)短串联重复序列(str)是存在于人类基因组中的高度多态性序列，反映的是dna指纹图谱。通过str检测可以排除交叉污染。经过str检测，人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm与来自于american type culture collection(atcc),deutschesammlung von mikroorganismen und zellkulturen(dsmz)，japanese collection ofresearch bioresources(jcrb)和riken(riken)典藏细胞数据库的2455个细胞系的str数据均无匹配。

17、(7)裸鼠体内致瘤实验表明，本发明建立的人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm在体内仍具备很好的致癌性。对4只balb/c-nu裸鼠进行体内成瘤实验，人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm系100％成瘤，1×106细胞注射于裸鼠皮下，饲养30天后，移植瘤体积大小为385.76±112.16mm3。

18、(8)细胞的小室穿膜实验显示，本发明提供的人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm具有穿膜能力，transwell小室的上室添加2×105细胞，培养72h后，迁移到下室的平均穿膜细胞数为110±18；在侵袭实验，培养96h后，侵袭到下室的平均穿膜细胞数为105±30。3d侵袭实验显示spd01lm具有向四周伸出伪足的高侵袭性特征。

19、(9)人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm对常用化疗药物的敏感性实验表明，spd01lm对5-fu(5-氟尿嘧啶)的ic50为0.1267±0.0053μm；spd01lm对oxa(奥沙利铂)的ic50为5.6873±0.4514μm；spd01lm对ptx(紫杉醇)的ic50为1.8463±0.2614nm；表现出对5-fu的高度敏感性。

20、(10)通过高通量药物筛选了包含634个化合物在内的抗肿瘤药物库，发现本发明的细胞系spd01lm对其中108个药物高敏感，并且与其余胃腺癌类器官细胞(gc1，50)、印戒细胞癌类器官细胞(gc2，21)、中分化胃腺癌类器官细胞(gc3，41)、另外的胃癌淋巴结转移灶类器官细胞(gc4，26)相比，具有更广泛的敏感药物谱。

21、本发明的有益效果如下：

22、1)本发明的人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm性状稳定，可稳定多次传代，为人胃腺癌淋巴结转移机制研究提供新的、更接近于临床生物学特性的实验材料。

23、2)本发明的人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm具有高度成瘤性，可以成功制备胃腺癌动物模型，所制的动物模型可以用于基础研究及药物筛选。

24、3)本发明的人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm具备高糖基化特征。

25、4)本发明的人胃腺癌淋巴结转移灶类器官细胞系spd01lm对5-fu(5-氟尿嘧啶)具有高度敏感性，且较其余多种类型胃癌类器官细胞具有更广泛的药物敏感谱。

26、5)本发明公开的细胞系spd01lm是人胃腺癌淋巴结转移临床前期应用的理想类器官细胞系。