汉防己乙素制备方法与流程

本发明涉及医药技术，具体涉及汉防己乙素制备方法。

背景技术：

1、药品是特殊的商品，其上市均应按照“药品注册管理办法”提交药品注册申请，经国家药品监督管理局批准，颁发药品批准文号后才允许上市。国家为保证药品的安全、有效、质量可控，制定了一系列的法律、法规(药典，指导原则等)，对药品的研发进行指导与规范。

2、如《中国药典》2020版附录9102“药品杂质分析指导原则”有如下描述：

3、杂质是药品的关键质量属性，可影响产品的安全性和有效性。药品杂质通常分为：有机杂质、无机杂质、残留溶剂。其中化学结构与活性成分类似或具渊源关系的有机杂质，通常称为有关物质。对于表观含量在鉴定阈值0.05％(原料药：0.1％或0.05％，选择更严的0.05％)及以上的单个杂质予以定性或确证其结构。

4、药品杂质鉴定与质控的决策树见图1。

5、可见，如单个杂质量超过鉴定阈值0.05％，需进行该杂质的结构鉴定，如果该结构对人有相关风险，必须将杂质减少到安全水平，如果无相关风险，也要降低到质控阈值，如果不能降低到质控阈值，需进行：①遗传毒性研究；②常规毒性研究；③其他特定的毒性终点，如判定有临床副作用，必须将该杂质量减少到安全水平。

6、文献(谢沐风仿制药研发中有关物质研究思路之我见[j].中国医药工业杂志.2013，44(11).1174-1182)报道，有关物质研究已成为仿制药研发的“重中之重”，我国自2007年修订《药品注册管理办法》以来，国家药品审评中心发布了大量有关物质研究指导原则、指南、电子刊物等。且该研究也已成为中心较之前的评审提高最为显著的一项指标要求和技术门槛。

7、可以说有关物质中单个杂质的量是否超鉴定阈值，是研发工作的分水岭，高于鉴定阈值，研发工作量及注册的法规风险将大为增加，反之，不仅研发工作量减少，门槛也下降，且注册成功率也高。

8、汉防己是防己科风龙属植物，其有效成分为生物碱，主要是汉防己甲素和汉防己乙素。汉防已甲素(tetrandrine，汉防已碱，粉防已碱)无色针晶，不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和氯仿等有机溶剂及稀酸水中，可溶于苯，mp 216℃，有双熔点现象，自丙酮中结晶者，1 5 0℃左右熔后加热又固化，至21 3℃复熔。汉防已乙素(fangchinoline，又称防已诺林碱，去甲粉防已碱)溶解行为与汉防已甲素相似，因有一个酚羟基，故极性较汉防已甲素稍高，在苯中的溶解度小于汉防已甲素而在乙醇中又大于汉防已甲素。

9、近年来发现，汉防己乙素对乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、白血病、肺癌等多种恶性肿瘤具有良好的抗癌效果。作用机制包括诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡、抑制细胞迁移和侵袭等，yang等研究报道汉防己乙素能够通过抑制pi3k/akt/mapk通路诱导细胞周期组织，抑制肿瘤细胞增殖；lee等研究表明汉防己乙素能够通过调节nr4a1通路促进胰腺癌细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤作用；sun等研究发现，汉防己乙素能够通过抑制p-糖蛋白活性进而逆转肿瘤细胞多药耐药。

10、但目前国内汉防己乙素原料及制剂均未有产品上市。

11、文献(陶曙红，喻蓉大孔吸附树脂在提取粉防己中汉防己甲素和汉防己乙素中的应用[j].时珍国医国药.2005，16(5).394)报道，用d101大也吸附树脂和硅胶柱层析分离汉防己甲素和乙素，两者的纯度经高效液色谱仪检测，均大于98％。硅胶柱层析的分离方法因硅胶用前需活化处理，操作过程要注意硅胶装柱方式，样品加样方式，洗脱流速，硅胶及洗脱剂用量大，不可重复利用，成本高等等限制，不适合工业化大生产。虽有含量检测的液相色谱条件，但未公开含量测定的具体方法，是对照品外标法，还是面积归一化法等。更未提及杂质的测定方法及最大单个杂质的量、各个杂质的量。

12、cn102649794a公开了一种汉防己乙素的提纯方法，具体如下：

13、(1)将汉防己药材粉末用醇液回流或冷浸提取，提取液回收溶剂至无醇味，加酸调至酸性；(2)将酸液调碱，用氯仿萃取，萃取液干法上ods硅胶柱，甲醇-水或者乙腈-水混合溶剂洗脱，洗脱液回收溶剂，干燥得汉防己乙素。实施例2的最高含量为99.3％，但未公开含量测定的具体方法，也未提及杂质的测定方法及最大单个杂质的量、各个杂质的量。

14、为了满足市场高纯度汉防己乙素需求，提供一种最大单个杂质量低于鉴定阈值，符合药品注册要求的汉防己乙素，利用常规溶剂改进生产工艺，可产出高质量汉防己乙素，减少药物使用副作用。

技术实现思路

1、本发明提供一种汉防己乙素制备方法，将汉防己原料经过提取分离，纯化，精制三个步骤最终得到纯度达到99.5％以上，最大单杂0.05％(鉴定阈值)以下的汉防己乙素。汉防己乙素有抗炎镇痛、降压、抗肿瘤等作用。本发明制备的最大单个杂质含量低于鉴定阈值的汉防己乙素用于药物的副作用更小。

2、一种汉防己乙素制备方法，包括：

3、1)取汉防己粉，用甲醇提取；将提取液过滤；滤液用中空纤维超滤膜超滤，超滤得到的液体再经纳滤膜减压浓缩，得到浓缩液；浓缩液过d101大孔树脂柱，用甲醇洗脱，收集下注液和洗脱液，将收集液体蒸至近干，加丙酮溶解过滤，再浓缩结晶得到汉防己乙素提取物；

4、2)将所述用丙酮溶解，过滤；然后浓缩，降温结晶，真空抽滤，得到汉防己乙素纯化物；

5、3)将所述汉防己乙素纯化物与水混合，用盐酸调ph至3-4，得到混合液；加入活性炭；搅拌(例如20-60min)，真空抽滤；滤液用液碱调至ph为10-11，用氯仿萃取，萃取液分层，氯仿层蒸干，加入95％乙醇，升温溶解(例如68-72℃)，搅拌(例如20-60min)，真空抽滤，滤液浓缩，降温结晶，真空抽滤，得到汉防己乙素一次精制精品；再加入95％乙醇，升温溶解(例如68-72℃)，搅拌(例如20-60min)，真空抽滤，滤液浓缩，降温结晶，真空抽滤，得到汉防己乙素二次精制精品。

6、根据本发明实施例，以kg:l计，汉防己粉与甲醇的重量体积比为5:(45-55)。

7、根据本发明实施例，用甲醇提取汉防己粉温度为55-65℃，例如60℃。通常可浸提3次，合并提取液。

8、根据本发明实施例，所述中空纤维超滤膜的截留分子量为1800-2200，例如2000。

9、根据本发明实施例，所述纳滤膜的截留分子量为280-330，例如300。

10、根据本发明实施例，依据色谱检测，从收集到的下注液和洗脱液中取含汉防己乙素纯度最高段，进行后续步骤。

11、所述色谱检测方法可参见下文。

12、根据本发明实施例，以g:ml计，汉防己乙素提取物与丙酮的重量体积比为1:(10-15)，例如1:13。

13、根据本发明实施例，步骤2)浓缩至原体积30-40％。

14、根据本发明实施例，步骤2)降温结晶的温度为8-10℃。

15、根据本发明实施例，步骤3)中，以g:ml计，所述混合液与活性炭的重量体积比为(25-35):1，例如30:1。

16、根据本发明实施例，步骤3)中，氯仿的用量为滤液体积的3-8倍。

17、根据本发明实施例，步骤3)中，95％乙醇的用量为滤液体积的15-25倍。

18、根据本发明实施例，步骤3)浓缩至原体积30-40％。

19、根据本发明实施例，步骤3)降温结晶的温度为3℃或以下。

20、根据本发明实施例，所述汉防己乙素制备方法，包括：

21、1)取汉防己粉，用甲醇提取；将提取液过滤；滤液用截留分子量2000的中空纤维超滤膜超滤，超滤得到的液体再经截留分子量300的纳滤膜减压浓缩，得到浓缩液；浓缩液过d101大孔树脂柱，用甲醇洗脱，收集下注液和洗脱液，分段收集液体，依据色谱检测，取含汉防己乙素纯度最高段，并将收集液体蒸至近干，加丙酮溶解过滤，再浓缩结晶得到汉防己乙素提取物；

22、2)将所述用丙酮溶解，过滤；然后浓缩至原体积30-40％，降温至8-10℃结晶，真空抽滤，得到汉防己乙素纯化物；其中，以g:ml计，汉防己乙素提取物与丙酮的重量体积比为1:(10-15)；

23、3)将所述汉防己乙素纯化物与水混合，用盐酸调ph至3-4，得到混合液；加入活性炭；以g:ml计，所述混合液与活性炭的重量体积比为(25-35):1；搅拌(例如20-60min)，真空抽滤；滤液用液碱调至ph为10-11，用3-8倍体积的氯仿萃取，萃取液分层，氯仿层蒸干，加入15-25倍体积的95％乙醇，升温至68-72℃溶解，搅拌(例如20-60min)，真空抽滤，滤液浓缩至原体积30-40％，降温至3℃以下结晶，真空抽滤，得到汉防己乙素一次精制精品；再加入15-25倍体积的95％乙醇，升温至68-72℃溶解，搅拌(例如20-60min)，真空抽滤，滤液浓缩至原体积30-40％，降温至3℃以下结晶，真空抽滤，得到汉防己乙素二次精制精品。

24、本发明利用超滤膜先从汉防己粉中提取出汉防己甲素和乙素，再通过溶剂纯化和精制等工序，得到纯度99.5％以上，单杂0.05％以下的高质量汉防己乙素。

25、本发明还包括上述方法制备的汉防己乙素，其最大单杂0.05％以下，例如0.04％。

26、本发明通过超滤膜进行生物碱提取相对比传统的有机溶剂提取，节约原料，减少环境污染，降低成本，除杂除热原效果好，空间占用少，再通过纯化和精制，能够得到纯度99.5％以上，且单杂能控制在0.05％以下的高质量汉防己乙素。根据《化学药物杂质研究的技术指导原则》规定，单杂不超过0.05％，属于鉴定限度以内，无需确定其化学结构，在满足原料药注册要求的前提下，减少杂质结构确认的工作量及费用。同时高纯度汉防己乙素用于药物的副作用更小。