本发明涉及生物工程和酿酒，具体涉及一种高温大曲二级菌剂的制备工艺。
背景技术：
1、功能微生物对大曲的质量有重要影响，将功能微生物接种到大曲中，可优化大曲微生物结构，避免杂菌污染。目前一般将微生物制成固态菌剂再接种到大曲中，以麸皮等原料为载体。麸皮是微生物的良好载体，同时又对有益于酿酒生产，所以利用麸皮作为二级菌剂的载体是可行的。
2、目前，主要将微生物制成菌剂接种到麸皮中，但微生物接种后存活时间较短，不适当的保藏方式也会造成微生物的死亡，难以应用到大曲生产过程中。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种高温大曲二级菌剂的制备方法，先将选定的微生物制成冻干菌剂，再将菌种以冻干菌剂的方式接种到麸皮载体上。由于冷冻干燥后的微生物存活时间得到延长，冷冻过程中添加的保护剂降低了微生物的受损程度，使得二级菌剂中含有足够的微生物，能够作为母曲接种到大曲生产过程中。
2、一种高温大曲二级菌剂的制备工艺，包括以下步骤：
3、(1)将21种微生物分为细菌类、霉菌类、酵母菌类；细菌类包括以下微生物：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、阿耶波多氏芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、腐生葡萄球菌、面包乳杆菌、食窦魏斯氏菌、戊糖乳杆菌、醋酸杆菌、酒酿醋酸杆菌、维罗尼假单胞菌；霉菌类包括以下微生物：米曲霉、爪哇毛霉、米根霉和谢瓦曲霉；酵母菌类包括以下微生物：异常毕赤酵母和扣囊覆膜孢酵母。
4、(2)将细菌类微生物中的15种微生物分别接种到牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基中恒温培养，然后转入牛肉膏蛋白胨液体培养基中摇床培养；将霉菌类微生物中的4种微生物分别接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中恒温培养，然后转入马铃薯葡萄糖液体培养基中摇床培养；将酵母菌类微生物中的两种微生物分别接种到酵母浸出粉胨葡萄糖固体培养基中恒温培养，然后转入酵母浸出粉葡萄糖液体培养基中摇床培养。
5、(3)将麸皮、稻壳和玉米芯磨碎，混合均匀，灭菌后，作为载体备用；
6、(4)将海藻糖、甘露醇、硫代硫酸钠和脱脂奶粉加入至无菌水中溶解，得到保护剂溶液，备用；
7、(4)将步骤(1)得到的细菌、霉菌和酵母菌分别加入至无菌生理盐水中，得到对应的菌悬液，然后将菌悬液和步骤(2)得到的载体加入至步骤(3)得到的保护剂溶液中，然后放入冰箱预冷，再转入液氮预冻，预冻完成后转移至冷冻干燥机，通过冷冻干燥机，真空干燥制成粉状冻干菌剂；
8、(5)将麸皮和水混合均匀后，灭菌，冷却，得到二级菌剂载体；将步骤(4)得到的细菌、霉菌、酵母菌的粉状冻干菌剂分别加入到二级菌剂载体中，恒温培养，干燥，制得成品高温大曲二级菌剂。
9、本发明先将各菌种在培养基上活化扩培后，接种到以麸皮、稻壳和玉米芯为原料的载体中，然后将载体放入以海藻糖、甘露醇、硫代硫酸钠和脱脂奶粉为成分的保护剂中，经冷冻干燥后制成冻干菌剂。之后将得到的粉状冻干菌剂接种到麸皮载体中，进行恒温培养，然后经干燥得到含有多种微生物的高温大曲二级菌剂。由于本发明制得高温大曲二级菌剂中的微生物是以冻干菌剂的方式接种的，延长了微生物菌种的存活时间，降低了菌种的受损程度，使该高温大曲二级菌剂能作为母曲接种到高温大曲生产过程中。
10、进一步地，步骤(1)中，所述微生物包括细菌类(地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、阿耶波多氏芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、腐生葡萄球菌、面包乳杆菌、食窦魏斯氏菌、戊糖乳杆菌、醋酸杆菌、酒酿醋酸杆菌、维罗尼假单胞菌)、霉菌类(米曲霉、爪哇毛霉、米根霉和谢瓦曲霉)和酵母菌类(异常毕赤酵母和扣囊覆膜孢酵母)。
11、进一步地，步骤(2)中，细菌类培养条件为：在牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基上37℃培养48h，然后接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，120rpm摇床培养48h。
12、进一步地，步骤(2)中，霉菌类培养条件为：在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基上30℃培养48h，然后接种到马铃薯葡萄糖液体培养基中，30℃，120rpm摇床培养48h。
13、进一步地，步骤(2)中，酵母菌类培养条件为：在酵母浸出粉胨葡萄糖固体培养基上30℃培养48h，然后接种到酵母浸出粉葡萄糖液体培养基中，30℃，120rpm摇床培养48h。
14、进一步地，步骤(3)中，载体制备方法为：将麸皮、稻壳和玉米芯磨碎，过50目筛，然后121℃条件下灭菌，然后混合均匀，制成一级菌剂载体，载体中麸皮、稻壳和玉米芯的质量占比为60％，30％和10％。
15、进一步地，步骤(4)中，保护剂制备方法为：将海藻糖、甘露醇、硫代硫酸钠和脱脂奶粉在121℃条件下灭菌，冷却后用无菌水溶解，制成保护剂溶液，其中海藻糖、甘露醇、硫代硫酸钠和脱脂奶粉的浓度分别为7％w/v、5％w/v、7％w/v和9％w/v。
16、进一步地，步骤(5)中，冻干菌剂制备方法为，将步骤(2)得到的细菌、霉菌和酵母菌分别加入至无菌生理盐水中，得到对应的菌悬液，然后将得到的菌悬液和菌剂载体加入至保护剂溶液中，然后放入-20℃冰箱预冷40min，再转入液氮预冻8～12h，然后转入冷冻干燥机进行真空干燥，真空干燥条件为：干燥压力45pa，隔板温度-40℃，冷阱温度-76℃，干燥时间100min。其中，细菌菌悬液浓度为1.08×109cfu/ml，霉菌菌悬液浓度为0.94×109cfu/ml，酵母菌菌悬液浓度为2.88×109cfu/ml。
17、进一步地，步骤(6)中，二级菌剂制备方法为，将250g麸皮放入1000ml三角瓶中，加入60％的水，调节ph7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却至50℃后分别加入细菌类、霉菌类和酵母菌类的粉状冻干菌剂，添加比例为6％。之后于35℃恒温培养6d，随后取出，50℃干燥至菌剂水分降至13％以下，随后将菌剂真空密封，保存。
18、本发明先将微生物菌种制成冻干菌剂，再以粉状冻干菌剂的方式接种到麸皮上，延长了微生物的存活时间，降低了菌种的受损程度，使二级菌剂含有足够的微生物，能作为母曲接种到高温大曲生产中。
19、上述的二级菌剂制备工艺制备得到的二级菌剂。
20、本发明的高温大曲二级菌剂，水分含量为2.41％，ph6.3，细菌生物量约为(4～8)×109cfu/g，酵母菌生物量约为(1～3)×109cfu/g，真菌生物量为约(3～6)×109cfu/g。
21、上述的二级菌剂在高温大曲生产过程中的应用。
22、进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述高温大曲二级菌剂在高温大曲生产中的应用，二级菌剂接种到高温大曲原料中的比例为5％w/w。
23、高温大曲二级菌剂在高温大曲生产中的应用的具体过程为：
24、a：称取小麦，用自来水冲洗后，用80℃～90℃开水润粮，开水量为小麦质量的8％w，润粮时间为5h。
25、b：研磨润粮后的小麦，过20目筛，使细粉率达到20％。
26、c：按小麦质量的40％量取35℃温开水，将其与上述小麦充分混合，然后称取小麦质量3％～7％的二级菌剂，加入到小麦与水中，混合均匀。
27、d：将上述物料填充至规格为275×180×7cm的洁净模具中，用传统方式压制物料，至物料出浆，物料紧密，形似砖块，将物料取出，形状尺寸为上述规格。
28、e：大曲培养：
29、(1)将接种好的大曲，置于6级空气洁净度的曲房内，每块大曲分层培养，自然温度，相对湿度95％左右，时间大约持续2d；
30、(2)2d后，品温达45℃以上时，每天通风培养30～40min，并视情况喷洒温开水于曲室上空，保持相对湿度90％左右，反复如此进行，时间大约持续4d；
31、(3)之后，品温在50～68℃之间，期间达到最高品温，相对湿度80％左右，时间持续5d，每天通风培养40～50min，每天喷水1～2次，反复如此进行；
32、(4)然后，品温开始下降，低于55℃时，翻曲；3d后连续抽风排潮，逐步降低温度和湿度，直到大曲水分降至约17wt％时，转移至另一洁净的室内，自然干燥20d，至水分低于13wt％时，出曲。
33、本发明具有以下有益效果：
34、本发明的高温大曲二级菌剂延长了微生物的存活时间，降低了菌种的受损程度，使二级菌剂含有足够的微生物，能作为母曲接种到高温大曲中，可减少大曲生产中对外源微生物的依赖性，并适当提升高温大曲的糖化力和液化力。