无核酸提取等温扩增结合CRISPR/Cas12a对LSDV的DNA和RNA检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物病毒检测领域，具体涉及两种等温扩增技术rt-era和lamp以及crispr/cas12a系统的检测方法。

背景技术：

1、牛结节性皮肤病病毒(lsdv)引起牛结节性皮肤病，是一种急性或者亚急性的传染病。患病牛会发烧，厌食，淋巴肿大，有皮肤结节，产奶量急剧下降，甚至不育和流产。lsdv传染性极强并且发病率高，给畜牧业和国际贸易带来了巨大的损失，甚至对小农户产生致命打击。世界动物卫生组织(world organization for animal health)将其归类为须报告的动物流行性疾病，中国农业部将其归类为2类动物疫病。然而，目前还没有明确的有效的治疗方法，因此牛和潜在携带者的临床诊断和隔离在感染预防和控制中起着至关重要的作用。对病毒的监测对于识别和控制病毒感染和传播变得越来越重要。

2、目前，聚合酶链反应(pcr)以及以pcr为基础的变温扩增是主要的lsdv检测手段，比如实时荧光定量pcr(qpcr)和巢式pcr。但他们都需要依靠精密的热循环器和训练有素的人员。这些对技术人员、昂贵的仪器和超净工作台的要求是对大规模检测和实时检测的挑战，特别是在资源有限的地区。近年来，等温扩增作为一种简便的核酸检测方法得到了发展。尤其是环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)和重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)以及酶促重组等温扩增技术(enzymatic recombinase amplification，era)。lamp依赖4个引物和bst dna polymerase在60-65℃靶标6个区域。rpa和era利用重组酶、单链结合蛋白以及dna polymerase在37℃快速扩增dna。据报道lamp和era以及rpa灵敏度与pcr相似。由于他们在等温条件下反应不依赖大型热循环仪器，快速和灵敏的特点，很快成为受欢迎的dna扩增技术。相比与以pcr为系列的扩增方法，等温扩增克服了技术和经济上的严格要求以及耗时长的缺点，他们成为了田间友好型检测方法。

3、扩增后的检测方法对检测的灵敏度和特异性有很大影响。通常采用荧光染料或者探针。但研究表明荧光染料可能会抑制双链dna或者rna的扩增。并且荧光染料不能解决非特异性扩增的问题，很容易产生假阳性。而探针方法仅能线性放大，在灵敏度上没有好的提升。crispr/cas12a系统凭借其顺式切割和反式切割活性可以提高灵敏度和特异性。具体而言，cas12a通过pam位点和crrna互补的方式找到靶标。结合靶标后，cas12a的两大活性被激活，分别切割靶标和附近任意的单链dna。其特异地识别靶标，可以识别正确的扩增产物，很大程度上解决了非特异性扩增带来的假阳性问题。crispr/cas12a的反式切割活性实现了信号放大的目的，单个靶标激活cas12a去切割多个单链dna。因此，crispr/cas12a与等温扩增技术相结合是特异的、灵敏的和简便的核酸检测方法，是非常适合point-of-care检测。

4、然而复杂的dna或rna提取程序和较长的周转时间限制了这些方法在快速和现场病毒检测中的应用。核酸提取是核酸检测的重要前提。由于多数聚合酶对ph、温度、和扩增抑制剂敏感。因此目前的核酸扩增或者核酸检测所用的试剂对核酸的纯度有高的要求。具体而言，未经过纯化的样本中带有大量的扩增抑制剂及干扰物质，甚至蛋白酶，使得聚合酶失活或者活性降低。为了降低干扰，各类核酸提取和纯化的试剂盒以及方法不断发展。比如，带硅胶膜的试管(genejet whole blood isolation kit,thermo scientific)、无硅胶膜的单管提取(kapa express extract kit)和苯酚-氯仿提取。研究表明，单管的效果最好。依据此，建立了单管萃取用于牛产前性别的无创的qpcr方法。另外，为了降低成本，一些自制的裂解液被开发，比如利用蛋白酶k和edta裂解组织，但是蛋白酶k对于多酶扩增体系是有损害的，并且需要很长的孵育时间。还有高温提取方法，比如75℃的高温或者phosphate-buffered saline(pbs,ph＝7.4)在98℃孵育10min用于释放核酸。这些方法需要额外的步骤来提高温度达到核酸释放的目的。并且方法需要核酸粗纯化的步骤。这是耗时和耗力的。而在另一项研究中表明，酸碱裂解方法的效果要高于高温裂解。但是强酸强碱对后续的步骤或多或少有影响。因此，研究新型的无需高温、不影响扩增的核酸提取免纯化的方法对核酸检测是至关重要的。

技术实现思路

1、本发明开发了无核酸提取的等温扩增结合crispr/cas12a对牛结节性皮肤病病毒dna和rna检测试剂盒。裂解液在室温条件下快速裂解样本，释放核酸，无需繁冗的核酸提取和纯化步骤。等温扩增rt-era技术利用重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶快速地扩增dna。此外，rt-era还包含反转录酶，因此它可以同时扩增dna和rna。在病毒侵染细胞的过程中，通常首先利用细胞中的原理大量转录rna和翻译出复制dna需要的蛋白。因此rna是病毒的早期检测的重要靶标。另外，利用bst 3.0dnapolymerase进行lamp反应，它不仅具有更快的dna扩增效率，且具有rna扩增能力。对扩增抑制剂有更大的耐受力。因此rt-era和lamp均可以扩增dna和rna。这在病毒的早期检测非常重要。此外，crispr/cas12a系统被介导成为终端信号输出模式，来提高方法的特异性和灵敏度。因此，依赖裂解液的rt-era-crispr/cas12a和lamp-crispr/cas12a的实际检测限低至2.169×101copies·μl-1和1.29×10-1tcid50。快速室温裂解液分别与rt-era-crispr/cas12a和lamp-crispr/cas12a检测平台结合，极大地简化了实验步骤，节省了时间和试剂成本。在等温条件下，两大检测平台可以快速地、特异地和灵敏地检测lsdv，方法在核酸检测中具有广阔的应用前景。目前国内外尚无基于快速室温裂解液的rt-era-crispr/cas12a和lamp-crispr/cas12a检测方法。因此，建立了室温快速的裂解液结合等温、快速和灵敏的检测方法对病毒的早期检测有重要意义。

2、为获得对lsdv更快速和灵敏的检测方法，本发明提供了基于快速室温裂解液的rt-era-crispr/cas12a和lamp-crispr/cas12a的两大检测平台准确鉴定lsdv。第一个目的是选择和等温扩增兼容的室温、快速的裂解液，可直接用于扩增，无需核酸提取和纯化；第二个目的是基于以上引物和crrna构建可以同时扩增dna和rna的等温扩增方法，实现病毒的早期检测，并不依赖大型精准的热循环仪器，降低成本。第三个目的是为提高灵敏度，构建快速、灵敏和特异的方法用于lsdv检测。

3、为了实现上述第一个目的，本发明采用的技术方案是：无核酸提取等温扩增结合crispr/cas12a对lsdv的dna和rna检测试剂盒，包括裂解体系中的裂解缓冲液和稳定缓冲液，等温扩增结合crispr/cas12a平台中的核苷酸序列如seq id no.1所示的f3引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的b3引物、核苷酸序列如seq id no.3所示的fip引物、核苷酸序列如seq id no.4所示的bip引物、核苷酸序列如seq id no.5所示的crrna和核苷酸序列如seq id no.6所示ssdnareporter。

4、所述裂解体系包括2-40μl血液样本或者细胞悬液、20μl裂解液和20μl稳定液。裂解体系包括以下步骤：

5、裂解样本：roomtemp sample lysis kit包含裂解液和稳定液。2-40μl血液样本或者细胞悬液添加到20μl裂解液(lysis buffer)中，涡旋混匀，低速瞬时离心收集至离心管底，室温放置3min。加入20μl稳定液(stabilizing buffer)，涡旋混匀，低速瞬时离心收集至离心管底，用于后续实验。

6、进一步，所述等温扩增结合crispr/cas12a平台为rt-era-crispr/cas12a平台或lamp-crispr/cas12a平台。

7、进一步，所述rt-era-crispr/cas12a平台包括rt-era和crispr/cas12a体系，所述rt-era体系包括：10～20μm f3引物和b3引物各2.5μl，20μl溶解液，20μl ddh2o，一管冻干粉，混匀后分装为2管，每管20μl，每管中加入2μl样本和1.5μl激活剂，在37℃反应40min；所述crispr/cas12a系统包含4μl rt-era产物、2μl 0.5～2μm cas12a、2μl 0.5～2μm crrna、1μl10～20μm ssdnareporter，9μl ddh2o和2μl 10×reaction buffer。

8、更进一步，所述f3引物和b3引物的浓度为15μm，cas12a的浓度为0.5μm，crrna的浓度为0.5μm，ssdnareporter的浓度为15μm。

9、检测方法包括以下步骤：

10、rt-era-crispr/cas12a检测平台包含rt-era和crispr/cas12a体系。rt-era体系包括：15μm f3引物和b3引物各2.5μl，20μl溶解液，20μl ddh2o，一管冻干粉，混匀后分装为2管，每管20μl。每管中加入2μl样本和1.5μl激活剂。它在37℃反应40min。取4μl产物加入crispr/cas12a系统。crispr/cas12a系统包含2μl 0.5μm cas12a、2μl 0.5μm crrna、1μl15μmssdnareporter，9μl ddh2o和2μl 10×reaction buffer。在g8荧光仪中37℃下收集荧光信号。

11、结果判定：出现荧光信号为阳性，无荧光信号为阴性。

12、进一步，所述lamp-crispr/cas12a平台包括lamp和crispr/cas12a体系，所述lamp体系包括5μm f3引物和b3引物各1μl，20～40μm fip引物和bip引物各1μl，1μl 8u·μl-1bst3.0dnapolymerase，3.5μl 10mm dntp，1.5μl 100mm mgso4，2.5μl 10×isoamp bufferii，2μl样本和10.5μl ddh2o；60℃反应50min；所述crispr/cas12a系统包括4μl lamp产物、2μl 0.5～2μm cas12a、2μl 0.5～2μm crrna、1μl 10～20μm ssdnareporter，9μl ddh2o和2μl 10×reaction buffer。

13、更进一步，所述fip引物和bip引物的浓度为20μm，cas12a的浓度为1μm，crrna的浓度为1μm，ssdnareporter的浓度为15μm。

14、检测方法包括以下步骤：

15、lamp-crispr/cas12a检测平台包含lamp和crispr/cas12a体系。lamp体系包含5μmf3引物和b3引物各1μl，20μm fip引物和bip引物各1μl，1μl 8u·μl-1bst3.0 dnapolymerase，3.5μl 10mm dntp，1.5μl 100mm mgso4，2.5μl 10×isoamp buffer ii，2μl样本和10.5μl ddh2o。混合物在60℃反应50min。取4μl产物加入crispr/cas12a系统。crispr/cas12a系统包含2μl 1μm cas12a、2μl 1μm crrna、1μl 15μm ssdna reporter，9μl ddh2o和2μl 10×reaction buffer。在g8荧光仪中37℃下收集荧光信号。

16、结果判定：出现荧光信号为阳性，无荧光信号为阴性。

17、在varv b22r基因上，lsdv比sppv和gtpv多36-38bp。根据此差异，设计了rt-era和lamp的引物和crrna，如下所示：

18、seq id no.1的核苷酸序列为：acaaagaatcgtaaaatgt。

19、seq id no.2的核苷酸序列为：tgttgtaaattaatatgatcaac。

20、seq id no.3的核苷酸序列为：

21、gagcaatttatttctttgtattaaa-ttttaaaaaaagaaaaaaaaaaggcatta。

22、seq id no.4的核苷酸序列为：

23、agaaagcaatacacacaatctat-agtgaataatgaactcagt

24、seq id no.5的核苷酸序列为：

25、aauuucuacuaaguguagauuaaaaaaagaaaaaaaaaaag。

26、seq id no.6的核苷酸序列为：

27、fam-tattatt-bhq1

28、本发明的优点包括：(1)、两个检测平台实现了无核酸提取和纯化，简化核酸检测步骤，缩短时间和降低成本；(2)、两个检测平台均可以对dna和rna检测，无需额外的步骤，实现了病毒的早期检测；(3)、等温扩增：re-era和lamp均可以在恒温条件下反应，其中rt-era可以在低温条件下反应，与crispr/cas12a可以更好的兼容。方法不依赖大型仪器，更适合point-of-care检测；(4)、高灵敏度：两大检测平台基于高效的等温扩增和灵敏的crispr/cas12a，实现了2次信号放大，检测限低至2.169×101copies·μl-1和1.29×10-1tcid50。(5)高特异性：针对varv b22r基因上lsdv独有的区域设计引物和crrna，使得rt-era和lamp具备高的特异性，crispr/cas12a系统消除了非特异性带来的影响，因此两大检测平台具有高的特异性；(6)、用途广和可编程性：两大检测平台不仅可以检测lsdv，通过改变引物和crrna序列，可以实现对多种dna或者rna病毒检测。