肝前体细胞及其建系方法和应用与流程

本发明涉及生物，尤其涉及一种肝前体细胞及其建系方法和应用。

背景技术：

1、细胞治疗方法，是一种相对安全有效且有前景的治疗方式。原代肝细胞是临床上最早应用于肝病治疗的细胞来源，1999年至2006年期间，原代肝细胞移植治疗克里格勒-纳贾尔综合征(英文名称为crigler-najjar syndrome，英文简称为cns)的8个临床案例中，全部患者血清胆红素整体下降了50％以上，2019年，英国a.dhawan团队采用微囊包裹原代肝细胞腹腔内移植治疗8名急性肝脏衰竭儿童，其中4名儿童避免了肝移植，3名儿童渡过急性期成功桥接到肝移植。但是基于肝细胞的细胞治疗和疾病模拟，一直受限于原代肝细胞在体外扩增能力限制。

2、细胞永生化是指细胞在体外培养的过程中，由于自身基因变化或者外界各种刺激因素如病毒感染等，避免了正常细胞的衰老死亡过程，获得了无限增殖能力，因此在体外可以长期传代培养、无限分裂增殖。在体外将原代肝细胞永生化，可能是一个可以解决原代肝细胞体外培养数量局限性的方案。

3、目前原代肝细胞的永生化方式主要有三大类：

4、第一类是与病毒基因相关的原代肝细胞永生化方式，猴肾病毒40t抗原(sv40t)、腺病毒eia和eib基因、人乳头状瘤病毒e6/e7基因、eb病毒永生化等，可通过各种机制失活细胞周期调节蛋白prb和p53，使得细胞绕过衰老期，持续传代。kobayashi等曾将含有编码sv40t肿瘤抗原的psv3neo质粒转染21周人胎肝细胞，而获得永生化肝细胞株oums-29永生化细胞株。不同病毒的永生化方法对于不同种类的细胞有适应性差异，hpv16病毒株的e6/e7基因能高效地建立永生化细胞株，同时大量研究表明hpv16-e6/e7对肝细胞的永生化有较好的适用性。鄢和新教授团队采用hpv16-e6/e7基因，将肝前体细胞永生化，可在体外持续传代40代次以上，并且表达肝前体细胞相关表面标记物。

5、第二类是端粒酶与端粒酶催化亚基相关的肝细胞永生化，htert作为端粒酶的催化亚基，与相关蛋白结合可以激活端粒酶，延长体外细胞培养的生存周期，是端粒酶的正向调控因子。wege等报道htert基因转染人胎肝细胞后，使细胞端粒延长，从而超越复制衰老期，该细胞在体外能传代300多代，并且能维持肝脏特有的功能。

6、第三类是可恢复永生化，日本kobayashi等将携带有sv40t抗原、单纯疱疹病毒胸苷激酶(英文名称为herpes simplex vires-thymi·dine kinase，英文简称为hsv-tk)及潮酶素(链霉菌产生的氨基糖苷类抗生素)抗性基因，并且两侧连接loxp位点的重组ssr69逆转录病毒导入原代成人肝细胞，成功地建立了可恢复的永生化肝细胞株nktk-3。利用表达cre重组酶的重组的腺病毒载体转染肝细胞，sv40t基因能被有效的切除，nktk-3细胞不再表达sv40t，肝细胞株恢复到永生化前的状态。

7、目前肝前体细胞的永生化技术并不成熟，多数永生化基因并不能将肝前体细胞改造为永生化细胞株，且并不能在体外持续传代。

8、因此，有必要提供一种肝前体细胞及其建系方法和应用以解决现有技术中存在的上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种肝前体细胞及其建系方法和应用，以解决现有技术中的永生化基因并不能将肝前体细胞改造为永生化细胞株，且并不能在体外持续传代的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种肝前体细胞的建系方法，包括以下步骤：

3、s0：提供肝前体细胞、混合液和重编程培养基，其中，所述混合液包括无血清培养基、聚乙烯亚胺和clp质粒；

4、s1：将所述肝前体细胞和所述混合液进行转染处理以得到转染后的肝前体细胞；

5、s2：将所述转染后的肝前体细胞放入所述重编程培养基中进行传代培养，以得到永生化的肝前体细胞。

6、本发明所述的肝前体细胞的建系方法的有益效果在于：本发明通过将所述肝前体细胞和所述混合液进行转染处理以得到转染后的肝前体细胞，将所述转染后的肝前体细胞放入所述重编程培养基中进行传代培养以得到永生化的肝前体细胞，本发明使用clp质粒对所述肝前体细胞进行转染，不会产生细胞毒性，然后通过在重编程培养基中进行传代培养，以使得转染后的肝前体细胞能够在体外持续传代。因此，本发明解决了现有技术中的永生化基因并不能将肝前体细胞改造为永生化细胞株，且并不能在体外持续传代的问题。

7、优选的，所述无血清培养基和所述聚乙烯亚胺的体积比为(500-1000):1。

8、优选的，所述clp质粒的终浓度为(1-5)μg/μl。

9、优选的，所述提供肝前体细胞的步骤包括：将肝细胞放入所述重编程培养基中进行扩增培养，然后将所述重编程培养基换成减血清培养基继续培养以得到肝前体细胞。

10、优选的，所述重编程培养基包括dmem/f12基础培养基，以及以占dmem/f12基础培养基的含量计：15-25ng/ml的肝细胞生长因子hgf，15-25ng/ml的上皮细胞生长因子egf，5-15μm的rock激酶抑制剂y27632，1-5μm的wnt信号通路激动剂chir99021，1-5μm的tgf-β信号抑制剂a8301，1-5μm的鞘氨醇-1-磷酸s1p and 5μm的吲哚乙酸lpa。

11、优选的，所述重编程培养基还包括n2营养补充剂、b27营养补充剂、丙酮酸钠和抗坏血酸。

12、优选的，所述重编程培养基包括dmem/f12基础培养基，以及以占dmem/f12基础培养基的含量计：含量为1-10％的n2营养补充剂，含量为1-10％的b27营养补充剂，1mm的丙酮酸钠，5-15μg/ml的抗坏血酸，15-25ng/ml的肝细胞生长因子hgf，15-25ng/ml的上皮细胞生长因子egf，5-15μm的rock激酶抑制剂y27632，1-5μm的wnt信号通路激动剂chir99021，1-5μm的tgf-β信号抑制剂a8301，1-5μm的鞘氨醇-1-磷酸s1p and 5μm的吲哚乙酸lpa。

13、本发明同时提供了一种肝前体细胞，由所述肝前体细胞的建系方法制备得到。

14、本发明所述的肝前体细胞的有益效果在于：本发明使用clp质粒对所述肝前体细胞进行转染，不会产生细胞毒性，然后通过在重编程培养基中进行传代培养，以使得转染后的肝前体细胞能够在体外持续传代。因此，本发明解决了现有技术中的永生化基因并不能将肝前体细胞改造为永生化细胞株，且并不能在体外持续传代的问题。

15、优选的，所述肝前体细胞阴性表达cd34、cd45和hla-drpq，所述肝前体细胞阳性表达cd24和cd326。

16、本发明又提供了一种肝前体细胞的应用，所述肝前体细胞应用于制备治疗急性肝衰竭的药物。

17、本发明所述的肝前体细胞的应用的有益效果在于：包含肝前体细胞的注射液对d-gal诱导剂联合lps诱导剂诱导的小鼠急性肝衰竭模型有显著疗效。